日期：2020年5月13日
杂志：Science
杂志影响因子：37.2
原文标题：Single-cell mass cytometry reveals cross-talk between inflammation-dampening and inflammation-amplifying cells in osteoarthritic cartilage
原文链接：https://advances.sciencemag.org/content/6/11/eaay5352
来源：Stanford University
摘要
衰老或损伤会导致软骨基质降解和骨关节炎（OA）的发展。由于缺乏针对OA软骨的单细胞研究，因此关于患者间细胞组成的可变性以及更重要的是，导致疾病的细胞亚群知之甚少。本文使用大量的细胞计数仪（mass cytometry）分析了健康和OA软骨样品，以建立单细胞图谱，揭示了不同的软骨细胞祖细胞和炎症调节亚群。这些稀有种群包括以白细胞介素-1受体1和肿瘤坏死因子受体II为标志的炎症放大（Inf-A）种群，其抑制作用降低了炎症；以CD24为标志的炎症抑制（Inf-D）种群，对炎症有抵抗力。设计了针对Inf-A和Inf-D细胞的药理策略，该策略可显着减少OA软骨细胞的炎症。使用该图集，将OA患者分为三组，以炎症细胞与再生细胞的相对比例为特征，从而有可能设计出精确的治疗方法。
内容
骨关节炎（OA）是一种与年龄相关的高度流行的关节疾病，其特征是软骨变性，活动能力丧失和慢性疼痛。 已经进行了许多工作来研究其复杂病因的几个方面，包括代谢，表观遗传，遗传和细胞因子。但是，目前尚无用于治疗OA的疾病改良药物，目前的治疗标准仅限于疼痛治疗，然后再进行关节置换。最近和正在进行的工作强调了衰老，炎症和多种组织再生潜能丧失之间的重要相互作用。尽管软骨是一个相对简单的组织，单个细胞类型被封装在其分泌的细胞外基质中，但与每位OA患者相关的变性程度不同，这表明在单个细胞水平上了解该组织可以提供有关发病和病理进展的信息。定义构成软骨的精确亚群也将有助于软骨组织工程或增强内源性软骨再生的策略。 与其他骨骼组织不同，软骨的再生潜力非常低。即使在青年时期遭受的伤害也没有得到修复，从而引起了纤维软骨组织，可导致OA病情加速。多项研究通过表征其细胞表面标志物探索了关节软骨中的假定软骨祖细胞（CPC）并描述其功能。值得注意的是，据报道CPC种群富集在OA软骨中，具有增加的迁徙潜力，形成高度克隆种群的能力和多能性（即在培养物中产生软骨细胞，成骨细胞和脂肪细胞的能力）。最近，鉴定出人骨骼干细胞（hSSC），这进一步提示了另一种修复细胞。然而，尽管存在这些假定的再生种群，但是在健康和患病状态下，总体软骨修复率仍然很低。甚至在年轻的非OA患者中，软骨修复也不尽相同，这些患者遭受与软骨相关的伤害，例如前十字韧带断裂或退化性半月板撕裂，有些患者恢复良好，而另一些患者则在大约十年后发展为OA。总体而言，这表明存在阻止组织有效修复和再生的因素，并且这些因素在患者之间有所不同。
这种有限修复的来源之一可能是关节经历的慢性炎症。 已知滑膜可被多种免疫细胞浸润，并且在OA患者的滑液中已检测到多种炎性细胞因子。此外，一些研究已经表征了缺氧因子（HIF），一氧化氮，活性氧ROS，NF-κB信号传导以及其他维持促炎环境的途径的作用。为了了解这种环境如何影响诸如CPC的再生种群，本文使用了单细胞大规模细胞仪（cyTOF）来绘制再生细胞种群和炎性种群。通过同时能够映射细胞身份和信号状态，我们可以观察细胞如何相互作用和相互影响。
高维细胞计数正常和OA软骨图谱
cyTOF技术可以轻松地在多个样本中分析大量细胞，而不会造成成本过高。 在蛋白质水平上的这种分析与单细胞转录组学是互补的，并且可以提供特定亚群中活跃信号通路的快照。这里才有了33个不同的标记基因来绘制软骨细胞图谱。样品来自接受全膝关节置换术的OA患者。每个样品的Col2a1 / Col1a1表达比在10到100之间，与正常相比，OA软骨中MMP3，MMP9和MMP13的表达高10到10,000倍。对SOX9和CD44染色的分析显示所有细胞上的染色水平很高，确保了样品处理过程中未观察到去分化的软骨形成表型。作者着手分析来自20个OA和5个正常样本的单细胞数据。 发现OA中表达NOTCH1的软骨细胞的扩增。
图1
高维细胞计数正常和OA软骨图谱
正常和OA软骨中的亚细胞种群组成
为了在正常和OA软骨中找到独特的亚群，这里使用FlowSOM算法基于细胞表面受体和细胞内标记物表达的相似性来定义簇（请参见原文方法）。FlowSOM在该数据中确定了20个簇或亚群，而且观察到OA患者与正常样品高度抗相关。广泛定义CPC群集或非CPC群集
图2
正常和OA软骨中的亚细胞种群组成
患者在炎症和非炎症CPC上的差异丰富
研究发现，CPC具有产生软骨细胞的能力，在培养中表现出自我更新并能够在OA软骨中迁移。这些CPC被认为是OA软骨中高度克隆的特征簇（20、21）的起源。 然而，它们在OA疾病病理中的作用仍不清楚，尤其是它们是否有助于疾病发作和进展。使用FlowSOM识别的20个聚类中，发现12个聚类以多种组合形式丰富集了这些CPC标记。
图3
OA患者的CPC类型差异
OA软骨中罕见的扩大炎症细胞群
为了进一步了解这些亚群的分子基础，作者们还使用了公开可用的单细胞RNA（scRNA）测序数据。能够成功鉴定出在scRNA测序数据中同时表达IL1R1和TNFRSF1B转录本的细胞。 这些细胞约占测序细胞的2％，验证了通过cyTOF观察到的频率。这些分析表明，IL1RI / TNFRII细胞可能起到将免疫细胞募集到关节间隙的作用。 因此，将其称为簇15和20炎症扩大（Inf-A）软骨细胞。
图4
内容
CD24 +软骨细胞可减轻OA软骨的炎症
已知细胞表面受体CD24在缓解健康和诱导性多能干细胞（iPSC）来源的软骨细胞中的炎症中的作用。发现CD24表达富集FlowSOM衍生的簇17和18（图5，A和C）。提示针对OA软骨中稀有细胞类型的多种组合可能有助于减轻炎症。
图5
CD24 +软骨细胞可减轻OA软骨的炎症
科研技能与思路实操培训，迅速提升科研能力，SCI文章与基金都会实现！1
【医药加】单细胞测序数据分析与课题设计
（网络精讲班）
（两天一晚 Zoom网络会议，时间：2020.7.4~7.5号）
为帮助正在或打算开展单细胞课题研究的科研人员尽快掌握单细胞相关研究的思路与方法， 考虑目前在疫情期间的实际情况，我们决定7.4-7.5号召开【单细胞测序数据分析与课题设计（网络精讲）学习班】，为了保证学习效果，我们采用国际顶级的ZOOM网络会议平台授课，效果体验好！
---发过Nature文章的大咖手把手教你单细胞测序数据分析与课题设计
【网络学习班背景】
单细胞测序是从单个细胞水平对基因组和转录组进行研究。2015年以来，10X Genomics、Drop-seq、Micro-well、Split-seq等技术的出现，彻底降低了单细胞测序的成本门槛。自此，单细胞测序技术被广泛应用于基础科研和临床研究。通过单细胞测序可以最大程度的反映细胞的异质性，发现新的细胞群和细胞亚群，并为阐明细胞状态转换的调控机理提供了技术保障。单细胞技术以及数据分析方法在肿瘤、发育生物学、免疫学、神经科学等领域有重要应用，是现今生命科学研究的焦点。
【学习班特色】
本次课程以近期CNS文章为案例主线，逐一详细剖析，全程电脑实战教学。理论与实践相结合，老师将以最简单易懂的方式，既介绍单细胞测序的研究方法、分析内容和最新前沿进展，又介绍具体的数据库、工具和软件的使用，并在课堂上进行上机指导。讲师经验丰富，教学深入浅出，能让大家获得从单细胞组学原始数据实现CNS图形绘制的实战能力。
【讲师背景】
中科院研究员，长期从事单细胞多组学方面的项目研究，目前已在Nature等杂志发表文章四十多篇，承担国家科技部、国家自然基金委和重点研发计划等多项课题。
【主要内容】详细内容见课表
1.熟悉单细胞组学图表解读和研究思路。
2.掌握单细胞组学分析标准流程和常用软件。
3.熟悉单细胞数据的分型和marker基因鉴定。
4.掌握单细胞数据的轨迹分析及功能富集分析。
5.了解单细胞课题设计方法及研究思路。
【预期目标】
本学习班由多年从事单细胞组学研究的科研人员授课，通过深入浅出的理论讲解和实例案例，帮助学员拓展研究思路，提升科研水平，增加职业竞争力。通过本次课程培训将使学员系统掌握当前主流的单细胞组学分析流程、方法和软件，从零基础实现到CNS图表的绘制，同时提升研究深度和广度，拓宽研究思路。
【使用软件】
主要使用R和Rstudio，部分涉及Lniux
以下为课程详细课表
单细胞测序数据分析及研究思路研讨会议程
第一天上午（理论）
9:00-10:30
单细胞测序技术与应用
1. 单细胞组学技术发展历程和原理介绍。
2. 单细胞测序技术在科研领域的应用。
3. 近年单细胞技术CNS文章思路解析。
10:30-10:45
茶歇
10:45-12:00
单细胞测序图标解读及思路
4. 单细胞文章常见图表解读。
5. 单细胞组学技术在癌症、发育、免疫及在植物等领域的研究内容及思路。
12:00-13:30
午餐及午休
第一天下午（实操）
13:30-15:30
Linux及R语言入门、软件安装
1. 常规基础Linux命令入门讲解及实操训练。
2. R语言简介及安装，RStudio的安装及使用说明。
3. R语言语法介绍及常用命令。
15:30-15:45
15:45-17:00
R语言数据处理实操
4. 数据处理功能及统计应用。
5. R语言画图实操：tSNE，小提琴图，热图，网络图，GO、KEGG富集图，GSEA等图形绘制。
17:00-18:00
晚餐及休息
第一天晚上（理论）
18:00-21:00
单细胞转录组数据分析思路及流程
1. 单细胞高分文章分析思路解析（细胞类群确定、拟时间分析、差异表达、通路富集、转录因子、配体受体互作等）。
2. 单细胞转录组比对、定量、分群及拟时间分析等软件及参数。
3. 单细胞转录组转录因子、功能通路及配体受体互作思路解析。
4. 单细胞组学分析常用数据库介绍及使用。
5. 基因富集分析和可视化。
第二天上午（实操）
8:45-10:30
单细胞数据可视化、细胞分型
1. 10X官方单细胞软件Cellranger讲解及实操。
2. 从基因表达矩阵开始到marker基因筛选全过程讲解及实操。
3. 通过Seurat软件进行PCA及tSNE降维。
10:30-10:45
茶歇
10:45-12:00
单细胞数据marker鉴定及差异分析
4. 单细胞转录组细胞鉴定及聚类分析。
5. 通过Seurat及GSVA等进行单细胞转录组差异分析。
12:00-13:30
午餐及午休
第二天下午（理论+实操）
13:30-15:00
单细胞数据轨迹分析，功能富集
1. 通过Monocle软件进行单细胞转录组拟时间分析。
2. 通过DAVID及metascape网站进行通路富集分析。
3. 单细胞数据分析总结。
15:00-15:15
茶歇
15:15-17:00
单细胞数据挖掘思路及标书构思、准备
1. 归纳总结零成本单细胞数据挖掘思路。
2. 单细胞测序基金申请思路、准备内容及注意事项等。
备注：必须携带电脑，上课主要软件为R和Rstudio，涉及部分Linux系统，讲师会详细带着操作
本站仅提供存储服务，所有内容均由用户发布，如发现有害或侵权内容，请
点击举报。
