迷迭香(Rosmarinus officinalis L.)别名艾菊、海之露,是唇形科迷迭香属常绿芳香型小灌木,起源于欧洲及北非地中海沿岸,为药食同源植物[1]。研究表明,迷迭香精油富含龙脑、桉树脑、蒎烯、莰烯和莰酮等萜烯类化合物[2](图1A),具有抑菌作用[3]。同时,迷迭香中的二萜(鼠尾草酸和鼠尾草酚)等具有很强的抗氧化活性[4],较目前广泛应用的人工合成的抗氧化剂叔丁基羟基茴香醚(BHA)和2,6-二叔丁基对甲酚(BHT),其抗氧化性高达4倍以上[5](图1B)。迷迭香主要种植在法国、意大利、北非摩洛哥等地[6]。中国在战国时期曾从西域引入种植,当时仅用于庭院观赏,20世纪70年代末和80年代初再次引入,今在北京、贵州、云南、广西等地有一定的种植面积[7]。鉴于迷迭香的多种功效和开发价值,笔者较系统总结了国内外迷迭香资源的多样性、组培技术、环境影响以及关键功能基因等方面的研究进展,并对未来的发展提出展望,为提升该物种的研究水平和更好地服务于生产提供参考借鉴。
迷迭香为迷迭香属(Rosmarinus)的小灌木。迷迭香属包含3个野生种,分别是迷迭香(R.officinalis L.)、 尾叶香茶菜(R.eriocalyx Jordan& Fourr.)和绒毛迷迭香(R.tomentosus Huber-Morath &Maire),以及2个杂交种R.×lavandulaceus De Noe和R.×mendizabalii Sagredo ex Rosúa,二者具有一个共同的亲本R.offcinalis,并分别以R.eriocalyx和R.tomentosus作为另外一个亲本。其中迷迭香广泛分布在环地中海地区;尾叶香茶菜仅局限在伊比利亚半岛南端(西班牙阿梅利亚省)和北非(摩洛哥、阿尔及利亚和利比亚);绒毛迷迭香是伊比利亚半岛南部格拉纳达省和马拉加省的地方资源,已被列入濒危植物[10]。Rosselló等[11]利用 ITS序列对迷迭香、尾叶香茶菜和绒毛迷迭香进行系统分类,分析表明迷迭香和尾叶香茶菜属于单起源,而绒毛迷迭香杂合了尾叶香茶菜的序列。Segarra等[10]利用同一地区生长的30个迷迭香单株开发了12个微卫星标记,在该群体中具有117个多态性位点,其中9个微卫星位点在尾叶香茶菜和绒毛迷迭香中分别检测到49个和45个多态性,各有21和12个特异位点,3个共有的多态性位点。这一套标记共检测到154个多态性位点,可以用作迷迭香属群体变异与杂交度等研究。
图1 迷迭香主要化学成分结构式
说明:A.精油中主要的单萜类物质[8];B.抗氧化物质迷迭香酸和鼠尾草酸[9]。
迷迭香属中仅迷迭香具有药用和工业价值。按照植物分类学,迷迭香植物分为3个亚种,依次是Rosmarinus officinalis subsp.officinalis、Rosmarinus officinalis subsp.palaui和 Rosmarinus officinalis subsp.valentinus[12]。officinalis亚种直立生长,株高可达1.8 cm,花萼长4.2~7.0 mm,花冠长8.5~13.5 mm,广泛分布在地中海盆地;palaui亚种植株匍匐生长,花萼5.0 mm,花冠小于10.0 mm,株高最高80.0 cm,枝条上叶片密生,叶片短而肉质,深绿色有光泽,花冠紫色,分布在西班牙巴利阿里群岛;valentinus亚种植株匍匐生长,株高最高只有20.0 cm,叶片窄而厚,绿色无光泽,白色花冠上有明显的紫色斑点,在西班牙巴伦西亚省有发现[12]。迷迭香经过长期的自然演化和驯化,已形成了丰富的品种和栽培种,并被引种到世界各地如美国、加拿大、英国、法国和中国等[13]。常见的品种有Albus、Arp、Aureus等20余种(表1),在生长习性、花色、叶形和枝条的着生状态等方面存在变异[14]。
利用RFLP标记检测直立和匍匐2种生态型迷迭香,发现二者在基因结构上存在差异[15],另外,利用精油组分、同工酶、RAPD标记联合分析发现其与迷迭香群体间的形态结构差异存在密切的相关性[16]。Mateu-Andrés等[17]采用plastid simple sequence repeat(cpSSR)标记系统分析来自地中海地区阿尔及利亚、西班牙、法国、希腊、意大利、利比亚、摩洛哥、葡萄牙和土耳其等9个国家47个地区的迷迭香群体,一共检测到17个变异,分为10个单倍型;贝叶斯分析显示,迷迭香起源于2个共同的祖先;群体扩张分析表明,迷迭香有3条扩张的路线:一条北部沿地中海路线,和两条南部路线,一是从西到东从北非到达利比亚地区;另一条从南部的起源中心向西南部到达利比里亚半岛。
表1 常见的迷迭香品种
迷迭香种子为小坚果,外表包裹粘液[18]。两室子房中只有一室可育,平均结实率仅为11.1%,而且萌发率极低[19],因此很少用种子繁殖。对不同种源迷迭香发芽率的研究发现,在15℃和光照条件下,迷迭香种子发芽率最高[13]。也有报道称低温(4.4℃)处理有助于提高迷迭香的发芽率[20]。迷迭香播种法繁殖周期长,幼苗生长缓慢,苗期分化明显,夏季抗虫性较差,一般只在品种驯化和品种选育时使用。目前,生产中常用的迷迭香繁殖技术为扦插繁殖。迷迭香的顶芽、年生枝条都可以作为扦插繁殖材料,扦插成活率在90%以上。前人已经对迷迭香种子繁育和扦插繁殖技术进行了很好的综述[19],笔者主要从组织培养角度对已有的研究进行综述。
组培苗的嫩芽、嫩稍也可以作为组培繁殖的材料,而且通过组织培养的方式,可以人为调节和控制培养条件而大量获得组织中有经济价值的成分。由于迷迭香中精油和抗氧化成分的效用,迷迭香组培技术的研究具有十分重要的意义。目前,常用的外植体有顶芽、叶片和茎段3种,常用培养基为MS培养基。
2.1 不同外植体组培技术
迷迭香叶片外植体一般取自幼嫩的枝条,叶片整体或切为4~5 mm小段,用10%次氯酸钠或2% HgCl2进行消毒,添加1.5 mg/L TDZ和0.5 mg/L IAA能促进叶片愈伤的形成[8]。董玉梅等[21]用0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA, 潘俊松等[22]用 1.0 mg/L 6-BA+0.025 mg/L IAA+0.1 mg/L NAA也成功诱导了叶片愈伤化。董玉梅等[21]发现,MS中添加高浓度蔗糖(50g/L)能缩短愈伤启动的时间和提高愈伤率。单一高浓度的6-BA(4.0 mg/L)能促进愈伤进行芽分化[8],而较高浓度的6-BA则需加入适量的KT+NAA,或IAA,利用后者分化率分别可达50%和70%[21-22]。
迷迭香茎尖外植体取自茎端0.7~1.2 cm、带有1~2个叶原基的部分。消毒方法类似于叶片,而HgCl2浓度宜降低到1%,以减少对幼嫩组织的伤害。采用0.8 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA激素组合可诱导丛生芽生长[22],而增加6-BA的浓度,在1.0 mg/L6-BA+0.02 mg/L NAA或0.2 mg/L IAA激素组合下可促进茎尖生长[22-23]。
茎段作为外植体需要进行预处理,先用杀菌剂(灭菌净或多荫灵等)对选取的枝段进行整体消毒,然后再用1%HgCl2消毒2次,每次2~3 min,将消毒后的茎段切为1.5~3.0 cm,带有1~2个腋芽的小段进行培养。在 1/2 MS或 MS添加 0.2 mg/L 6-BA+0.01 mg/L IBA的培养基上都可以启动腋芽的生长[24-25]。 芽增殖培养阶段,张华通[24]利用3/4 MS+0.2 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA,许秀玉等[25]利用1/2 MS+0.3 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA培养基,可诱导芽数3.0~3.5个,在这些研究中还发现椰乳具有降低芽枯萎和玻璃化的功效,以及加入适量活性炭可以促进小芽的生长。张树河等[26]研究表明,从腋芽诱导到芽增殖阶段均使用高浓度的营养物质和细胞分裂素,外植体增值率可达到3.7倍。相比较而言,在增值率相当的情况下,前2种培养基更经济一些。
2.2 迷迭香组培过程中不定根诱导的方法
将1.5~5.0 cm不定芽从愈伤块上切下,进行生根培养,已报道的生根培养基有以下几种类型(表2),生根可采用的MS浓度范围较广:1/4 MS~MS;添加生长素NAA、IBA以及IAA都有较好诱导生根的效果,使用浓度一般在0.1~0.5 mg/L(表2),增加激素的使用量,一定程度上可提高生根率[21,26]或缩短生根的时间[22,25]。同时添加活性炭或者多效唑PP333能促进小苗的生长,有壮苗壮根的效果[24-25],另外,蔗糖的浓度对生根也有一定的影响,张华通[24]研究表明,降低蔗糖的浓度可能有利于迷迭香生根。当不定根长至2 cm左右,开盖炼苗7 d左右,可以进行移栽。
2.3 营养添加剂和组培条件影响愈伤组织和再生苗中活性物质的含量
由愈伤、悬浮细胞、原生质体产生的再生苗在遗传和表观遗传学水平上发生了诸多变化,导致再生苗和母本材料在某些性状上的差异[27]。与母本相比,迷迭香组培材料含油量较高,精油组分差异较大,且具有品种特异性。扦插繁殖苗与组培苗相比,二者含油量差异虽不显著,但莰烯、柠檬烯和芳樟醇等精油组分含量发生了变化,并且利用组培方法获得的植株中柠檬烯和芳樟醇含量较高[8]。
Tawfik[8]研究表明,TDZ、6-BA、蔗糖和 Ca2+对愈伤组织或再生苗中活性物质含量有显著影响。其中,高浓度TDZ能增加莰酮,而降低茨醇的含量,可能是其促进了茨醇向莰酮转变的酶的活性[28];6-BA促进再生株的干物质量和1,8-桉树脑的增加,但其抑制α-蒎烯和莰烯的产生;蔗糖与茎尖诱导愈伤的鲜物质和干物质量成正比,并且特异的与乙酸龙脑酯含量正相关,但是高浓度的蔗糖会使迷迭香生长速率变慢;低浓度Ca2+产生暗绿色的完整愈伤,而高浓度Ca2+产生浅绿色易碎的愈伤,愈伤的鲜重最大,但是干重最小。3 mmol/L Ca2+有利于1,8-桉树脑和乙酸龙脑酯的积累,而0.99 mmol/L Ca2+时愈伤的干鲜重、产油量和莰酮含量最高。
不同光质也会影响愈伤组织的生长和生理变化。迷迭香愈伤组织的鲜重生长量在不同光谱下的差异依次为:红光>蓝光>黑暗>白光>黄光>绿光。红、绿和黑暗下的愈伤组织颜色相对较浅,质地疏松;而蓝、白和黄光培养下,愈伤颜色较深、质地紧实[29]。分析愈伤组织中黄酮含量发现红光不利于黄酮的积累,而蓝光下黄酮含量最高,不同光质下黄酮的产量为蓝光>黄光>黑暗>白光>红光[30]。
表2 生根培养基及生根效率比较
说明:表中激素和PP333施用量的单位均为mg/L。
3.1 水分胁迫
迷迭香生长在干旱和半干旱钙质型土壤的地中海盆地,面临严峻的环境胁迫。因此,干旱和盐碱环境胁迫对迷迭香的生理生态影响成为研究者关注的焦点。有研究表明,35%相对含水量处理3个月,迷迭香叶片的叶绿素、叶黄素和β-胡萝卜素含量下降,α-生育酚含量上升;迷迭香酸的氧化产物松香烷二萜类的异迷迭香醇含量增加了8倍。由于叶绿素的损失,减少了叶片吸收光子的量,导致叶黄素、α-生育酚和二萜与叶绿素比例增加,意味着叶片每吸收单位量的光子,其光学保护和抗氧化的能力得到增强[31]。当生长环境中相对含水量为42%,迷迭香CO2同化率减少为80%,但是光系统II的最大效率和叶片叶绿素含量没有改变;α-生育酚增加15倍,类胡萝卜素、异迷迭香酚和二甲基异迷迭香酚增加25~40%,这些物质含量的升高可能阻止干旱条件下植物的氧化损伤[32]。Munné-Bosch等[33]研究表明,鼠尾草酸和其氧化产物鼠尾草酚、迷迭香酚和异迷迭香酚主要分布在迷迭香叶片的叶绿体内,说明鼠尾草酸在叶绿体中可能充当抗氧化剂的功能。有证据表明,鼠尾草酸可能协助另外一种抗氧化剂α-生育酚进行叶绿体内活性氧清除[34]。除了迷迭香体内抗氧化物质的变化,随着干旱胁迫增强,迷迭香释放挥发性有机化合物(VOCs)的总量减少,种类增多,说明迷迭香还能够通过调节VOCs的含量来提高抗旱性[35]。
3.2 盐离子胁迫
不同离子对迷迭香次级代谢产物具有深远的影响。用100 mmol/L NaCl处理4周,迷迭香叶片中Na+含量增加了35%,同时K+、Ca2+和Mg2+等离子含量显著降低。 高剂量的 KCl(10 mmol/L)和 CaCl2(8 mmol/L)可以将NaCl处理后叶片中Na+含量降低到正常水平,而MgCl2和FeCl3的添加将Na+降低到正常水平以下[36]。
此外,100 mmol/L NaCl显著增加了1,8-桉树脑和樟脑烯的含量。添加KCl和CaCl2不能改变NaCl处理对精油成分的影响,但是加入高剂量的的MgCl2(8 mmol/L)可以使NaCl处理的1,8-桉树脑和樟脑含量恢复到正常水平,而低剂量的FeCl3(0.1 mmol/L)能降低樟脑烯含量[36]。100 mmol/L NaCl处理不会影响迷迭香二萜类物质的含量,添加KCl 和CaCl2能增加NaCl胁迫下叶片中鼠尾草酸的含量,降低迷迭香酚的含量,同时高剂量MgCl2和低剂量的FeCl3能分别降低盐胁迫下鼠尾草酚和迷迭香酚的含量[36]。总而言之,迷迭香是相对耐盐的植物,虽然NaCl处理不影响其生物产量和二萜类物质的含量,但是能显著改变其精油的组成,NaCl对迷迭香活性成分的影响还受到不同金属离子的协同调节。
苯丙氨酸和酪氨酸是迷迭香酸合成的前体,苯丙氨酸解氨酶(PAL)为迷迭香酸合成的关键酶之一(图2A)。脯氨酸作为一种还原剂促进代谢前体进入莽草酸和苯丙烷代谢途径,最终形成迷迭香酸[37]。用脯氨酸和色氨酸处理能增加迷迭香愈伤组织中PAL的活性,促进迷迭香酸的产生[38]。El-Naggar等[39]研究表明,PAL在迷迭香品种Majorca、R.officinalis和Madeline Hill表达量较高,而在Pine Scented和Arp 2个品种中表达量较低。PAL的表达量与核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的表达成反比。在愈伤组织中,PAL表达量高的材料迷迭香酸含量最高,反之亦然。
迷迭香中的鼠尾草酸和鼠尾草酚是主要的抗氧化物质,对神经退行性疾病有抑制的作用[40],但这些物质的合成途径尚不清楚(图2B)。Brückner等[41]应用液相-质谱联用技术分析发现,迷迭香酚类二萜物质的合成主要发生在幼叶的腺毛中。在酵母和烟草中表达迷迭香柯巴基焦磷酸合成酶(RoCPS1),可以将牻牛儿牻牛儿基焦磷酸(GGDP)转化为柯巴基焦磷酸(CDP);同时迷迭香贝壳杉烯类似合成酶RoKSL1和RoKSL2都可以利用CDP产生松香烷。与SmKSL和南欧丹参中分离的香紫苏醇合成酶类似,RoKSL1/2属于二萜合成酶TPS-e类,缺失了γ-结构域,RoKSL1和RoKSL2的酶化产物属于丹参酮二烯。相比之下,在单子叶植物中KSL酶参与赤霉素的代谢。进化分析表明,KSL是在双子叶-单子叶植物分化之前,在唇形科植物中出现的一组参与特殊代谢反应的酶[41]。
迷迭香是一种重要的香料作物,前人从形态(叶色、花色)、 化学组成(气味)以及分子标记(SSR、RAPD、RFLP和SNP)等方面对迷迭香资源进行了研究,然而,目前的研究对象主要还局限在环地中海地区,在中国种植的迷迭香还存在资源来源不清晰,品种混淆等问题。如何根据各地区气候、土壤等特点选择合适的种质资源进行育种与栽培是后续研究的主要方向之一。
图2 植物中鼠尾草酚和迷迭香酸生物合成途径
说明:A.彩叶草(Coleus blumei)悬浮细胞中发现的迷迭香酸合成途径[42];B.鼠尾草酸合成途径[43]。PAL:苯丙氨酸解氨酶,CAH:肉桂酸-4-羟化酶,4CL:对羟基肉桂酸-CoA连接酶,TAT:酪氨酸氨基转移酶,HPPR:羟基苯丙酮酸还原酶,HPPD:羟基苯丙酮酸双加氧酶,RAS:羟基肉桂酰-CoA:羟苯乳酸盐 羟基肉桂酰转移酶,3-H:羟基肉桂酰-羟苯乳酸盐3-羟化酶,3′-H:羟基肉桂酰-羟苯乳酸盐 3′-羟化酶,CPS:柯巴基焦磷酸合成酶,KSL:贝壳杉烯合成类似酶。实线箭头表示确定的关系,虚线箭头表示可能的关系,加注下划线的字表示在迷迭香已经开展研究的化合物或酶。
迷迭香主要通过扦插、压条等无性方式进行扩繁,这种方法能快速、稳定的繁殖具有某些优良性状的资源,但不利于突变的产生。详细综述了迷迭香组织培养相关研究进展,期望通过组培过程中引入诱变剂实现人工诱变育种,或者为迷迭香工厂化生产和转基因育种提供技术储备。
通过提高迷迭香广适性增加原材料的产量,以及通过提高活性物质含量(精油、抗氧化剂)增加有效产量是提高迷迭香经济价值的主要途径。目前对迷迭香活性成分的合成规律和关键基因的表达、功能等方面的研究主要针对迷迭香酸、鼠尾草酸等,而且关于2种物质合成的代谢通路没有系统分析,继续完善这2条代谢通路以及研究迷迭香中其他成分关键基因的功能分析也是未来研究的重要方向。
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