酸枣仁为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa (Bunge) Hu ex H. F. Chou的干燥成熟种子，具有补肝、宁心、敛汗、生津的功效[1]。酸枣仁中主要含有皂苷、黄酮、脂肪油和挥发油等多种成分。其中，酸枣仁皂苷是酸枣仁中含量较高、化学结构复杂及药理作用广泛的一类有效成分[2-3]。目前已从酸枣仁中鉴定到31种皂苷类成分[4]，主要有达玛烷型四环三萜类皂苷和齐墩果烷型、羽扇豆烷型、ceanothane型等五环三萜类皂苷。现代药理学研究表明，酸枣仁皂苷是酸枣仁发挥镇静安神作用的主要药效成分，在神经系统、免疫系统、心脑血管系统等方面亦表现出广泛的药理活性[5-11]。
失眠在睡眠障碍的分类中占主导地位，并在近年来成为一个日益严重的公共问题，根据我国睡眠研究会公布的最新调查结果显示，2022年中国成年人的失眠发生率高达38.2%[12]。失眠会影响学习记忆的形成和巩固，并引发焦虑、抑郁等精神疾病，严重影响工作和生活[13-15]。研究表明，失眠通过影响海马结构及神经递质的水平进而影响海马神经可塑性[16]，造成学习记忆损伤；失眠通过引起氧化应激反应抑制海马中抗氧化酶的生成、活性氧的过度增加、脂质过氧化和DNA修饰等生理或病理过程而引起神经元损伤，间接造成学习记忆损伤[17]；失眠可通过激活海马中炎症因子，导致神经损伤，进而造成学习记忆损伤[18]。海马对睡眠觉醒也发挥着重要的调节作用[19]。
对氯苯丙氨酸（PCPA）失眠模型是评价药物镇静催眠作用中最常用的诱导睡眠障碍药理模型[26-27]。PCPA是一种特异的、不可逆的色氨酸羟化酶（TPH）抑制剂，TPH是5-羟色胺（5-HT）生物合成的限速酶。色氨酸可经TPH催化生成5-羟色氨酸（5-HTA），5-HTA进一步脱羧生成5-HT。因此，ip PCPA会抑制色氨酸羟基化而阻断5-HT的合成[28]，从而导致动物外周和中枢神经系统5-HT水平显著降低，昼夜节律消失，几乎完全失眠[29]。5-HT是与睡眠关系最密切的神经递质之一，在慢波睡眠诱导和维持中具有重要作用[30]。目前以5-HT水平的显著变化作为PCPA失眠模型评价指标在文献中较为常见[31-34]。
海马区是大脑中枢神经系统中最复杂的部位，主要参与机体近期记忆中的情节记忆及空间位置的学习[35]。外源性注射PCPA后，海马结构受到损伤，引起单胺类神经递质（5-HT、去甲肾上腺素、多巴胺等）、氨基酸类神经递质[γ-氨基丁酸（GABA）、谷氨酸等]及与记忆相关的细胞因子[一氧化氮（NO）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α等]水平变化[36]，进而导致学习记忆损伤[37]。
为深入探讨酸枣仁总皂苷改善失眠大鼠学习记忆的作用及其机制，本研究复制PCPA失眠大鼠模型，采用旷场实验总路程、静止时间及血清中5-HT水平评价失眠模型；通过逃逸潜伏期、目标象限停留时间、目标象限总路程、平均速度、进入目标象限次数等水迷宫行为学指标、海马组织生理病理结构变化及海马中神经递质含量，评价酸枣仁总皂苷改善PCPA失眠引起的大鼠学习记忆减退作用，结合代谢组学技术多角度探索酸枣仁总皂苷改善学习记忆损伤的可能机制。
1 旷场实验结果
如图1所示，与对照组比较，模型组大鼠总路程显著增加（P＜0.01），静止时间显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠总路程显著降低（P＜0.01、0.001），静止时间显著升高（P＜0.05、0.01），表明酸枣仁总皂苷具有镇静催眠的作用。
2 Morris水迷宫行为学实验结果
2.1 定位航行实验结果
以逃避潜伏期为指标评价失眠大鼠空间学习能力。在经过4次的引导训练后，各组大鼠逃避潜伏期均有不同程度的下降，第4次训练即最终定位航行测试结果，见图2。与对照组比较，模型组大鼠逃避潜伏期显著增加（P＜0.05）；与模型组比较，地西泮组和酸枣仁总皂苷低剂量组大鼠逃避潜伏期显著降低（P＜0.05、0.01）。
2.2 空间探索实验
采用大鼠水迷宫测试仪跟踪成像系统对各组大鼠在水池中的运动轨迹进行记录，见图3。原平台所在象限为第IV象限，对照组大鼠入水后能够自主地去第IV象限寻找平台，轨迹较为松散；模型组大鼠的轨迹集中分布在入水的第I象限内，较少去探索其他象限；地西泮组大鼠入水后活动减少，出现静止漂浮水面的现象，个别大鼠在水中无规律的运动；酸枣仁总皂苷低、高剂量组大鼠在平台所在的第IV象限内徘徊，并在入水后有直线进入第IV象限的趋势，提示给予酸枣仁总皂苷后，大鼠学习记忆能力有所回调。
利用GraphPad Prism软件对目标象限停留时间、进入目标象限路程、平均速度和进入目标象限次数4个指标进行分析。如图4所示，与对照组比较，模型组大鼠在撤去平台后进入第IV象限时间、路程、次数及平均速度均显著降低（P＜0.01），在实验中观察到其多在入水处徘徊或无目的的探索情况；与模型组比较，各给药组大鼠进入目标象限的路程、停留时间、次数及平均速度均显著延长（P＜0.05、0.01），表明酸枣仁总皂苷能够改善失眠大鼠的学习记忆能力。
3 大鼠海马病理切片结果
如图5所示，模型组大鼠海马组织出现明显损伤，在海马齿状回区胞质空泡化严重，同时神经元细胞出现皱缩，染色加深，胞核胞质分界不清，可能影响到信号的传导及神经元的产生。与模型组相比较，各给药组大鼠海马胞质空泡化损伤均有不同程度改善，但仍存在神经元萎缩现象，酸枣仁总皂苷低剂量组大鼠海马切片较为接近对照组，与行为学结果一致。
4 酸枣仁总皂苷对失眠大鼠海马组织中5-HT、GABA和NO水平的影响
如图6所示，与对照组比较，模型组大鼠海马组织中5-HT、GABA和NO水平均显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组海马组织中5-HT、GABA和NO水平均显著升高（P＜0.05、0.01）。
5 海马代谢组学研究结果
5.1 海马组织样品液质轮廓分析
为考察各组大鼠体内代谢组学的整体变化，对原始数据进行预处理，采用SIMCA-P软件对海马组织样品进行PCA分析，在正、负离子模式下质控样品中分别有100%、99%峰的RSD值＜30%，表明该方法有较好的稳定性及重复性，数据可靠。如图7所示，正、负离子模式下对照组与模型组明显分开，且组间距离较远，表明模型组与对照组大鼠的内源性代谢物存在较大差异，而各给药组均可回调这种差异。
5.2 潜在标志物预测分析
为了对比酸枣仁总皂苷对大鼠海马组织样品内源性代谢物的影响，进一步对对照组和模型组、模型组和酸枣仁总皂苷低剂量组进行有监督的OPLS-DA分析，结合VIP＞1、P＜0.05筛选潜在生物标志物的候选变量。图8-A、B为对照组和模型组的OPLS-DA图，2组可沿X轴明显分开，组间差异较大，表明模型组大鼠代谢轮廓发生改变，即在正、负离子模式下，ip PCPA显著影响了大鼠海马中的内源性代谢物。200次模型验证结果表明（正离子模式下R2＝0.996、Q2＝0.954，负离子模式下R2＝0.996、Q2＝0.967），模型可靠，具有良好的预测能力，可用于后续差异代谢物的筛选。S-plot图中红色点即为VIP＞1的代谢物，表明这些代谢物对组间贡献度较大，可能是两组间的差异代谢物。同时对模型组和酸枣仁总皂苷低剂量组进行OPLS-DA分析，结果见图8-C、D。
5.3 海马组织样品差异代谢物的确定
将筛选得到的差异性代谢物与mzcloud、mzvault、HMDB等数据库对化合物信息进行比对，共鉴定出18个差异代谢物。为了进一步分析模型组及各给药组海马组织样品中18个内源性差异代谢物的动态变化规律，将各组差异性代谢物的峰面积数据导入Graphpad软件绘制箱图，结果见图9。
与对照组比较，模型组10种氨基酸类（精氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、赖氨酸、色氨酸、组氨酸、焦谷氨酸、苏氨酸）及2种酰胺类（谷氨酰胺、油酰胺）和其他类（二苄胺、胆碱、肌苷、胞嘧啶）共16种代谢物含量均显著降低（P＜0.05、0.01、0.001），十六酰胺、十八烯酸2种差异代谢物含量显著升高（P＜0.001）；与模型组比较，酸枣仁总皂苷低剂量组10种氨基酸、2种酰胺类代谢物和肌苷、胞嘧啶共14种差异代谢物含量显著上调（P＜0.05、0.01、0.001），十六酰胺、十八烯酸2种差异代谢物含量显著下调（P＜0.05、0.001）。
5.4代谢通路分析
将酸枣仁总皂苷显著回调的16种差异代谢物（精氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、赖氨酸、色氨酸、组氨酸、焦谷氨酸、苏氨酸、油酰胺、谷氨酰胺、肌苷、胞嘧啶、十六酰胺、十八烯酸）分别导入MetaboAnalyst 5.0数据处理中心进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）代谢通路富集和网络构建，基于拓扑分析进行权重计算，通过对P值、Holm P、误判率（FDR）及通路影响值的综合分析，得到代谢通路富集气泡图，结果见图10。
酸枣仁总皂苷可通过7条主要代谢通路调控大鼠海马代谢，最重要的是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成代谢通路，其通路影响值可达到1。其余比较关键的代谢通路按通路影响值由高到低排列依次为苯丙氨酸代谢、精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢、组氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢等。本研究中所涉及到的代谢通路均是氨基酸代谢通路，提示酸枣仁总皂苷能够调控海马组织中氨基酸代谢水平。
代谢组学结果表明，酸枣仁总皂苷能够通过多种途径调控失眠大鼠体内异常代谢，主要涉及到7条主要相关氨基酸代谢通路，为了进一步明确酸枣仁总皂苷在体内代谢机制，结合KEGG及相关富集分析方法，绘制代谢途径网络图，见图11。
讨论
本研究建立PCPA大鼠失眠模型，利用旷场及Morris水迷宫等行为学实验评价酸枣仁总皂苷对学习记忆损伤的药效作用，采用HE染色法观察大鼠海马组织病理变化，ELISA测定海马组织中5-HT、GABA及NO水平，并结合代谢组学技术对大鼠海马组织代谢轮廓进行分析，采用多元统计分析筛选差异性代谢物，基于MetaboAnalyst 5.0数据库进行代谢通路及代谢网络分析，从多角度探索酸枣仁总皂苷改善失眠大鼠学习记忆损伤的作用途径。
研究表明，慢波睡眠与快速眼动睡眠能够巩固学习记忆的形成，且与神经递质水平的变化有关[41]。5-HT能够参与机体睡眠-觉醒过程，并且与动物觉醒呈正相关，对慢波睡眠的发生和维持起着重要作用[42]，5-HT水平升高有利于维持睡眠状态[43]，本研究结果显示，酸枣仁总皂苷可通过上调海马组织中5-HT水平维持睡眠状态。GABA是抑制性神经递质，可阻断中枢神经兴奋传导和过度放电，当其表达下降时，促觉醒核团功能增强，诱发觉醒[44]。酸枣仁总皂苷能够显著上调海马组织中GABA水平，从而发挥改善学习记忆的作用。NO能够调节神经递质释放、突触可塑性的发育，与学习记忆的形成过程有着紧密的联系[45-46]。本研究表明酸枣仁总皂苷可显著回调海马组织中5-HT、GABA与NO水平，从而发挥直接改善学习记忆损伤的作用。
本研究发现，低、高剂量的酸枣仁总皂苷均能显著减少大鼠旷场实验的总路程，延长静止时间，增加水迷宫指标中目标象限停留时间、平均速度及进入次数，提高海马组织中5-HT、GABA、NO的水平，但低剂量组效果稍优于高剂量组，为非线性量-效关系。中药的内在成分极其复杂，不符合中药剂量-效应关系，可能是中药各种成分之间产生拮抗作用的结果，从而降低其药理活性[47]。此外，中药通常还具有双向调节的作用，低剂量具有促进效应，高剂量具有抑制效应。研究表明，GABAA受体参与调节学习记忆[48]，酸枣仁皂苷B能激活GABAA受体的表达[49]，从而改善学习记忆，但高剂量的酸枣仁皂苷B会使GABAA过表达，造成学习记忆损伤[50]。因此，酸枣仁总皂苷改善学习记忆损伤未呈现量效关系可能是上述原因造成的。
苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成途径是酸枣仁总皂苷调控海马组织中最为主要的一条代谢途径。苯丙氨酸和酪氨酸与体内神经递质水平息息相关，苯丙氨酸可以经过苯丙氨酸羟化酶的作用合成酪氨酸[51]，进而产生多巴胺、去甲肾上腺素以及肾上腺素，这些兴奋性神经递质均密切参与睡眠-觉醒过程，是引起失眠的重要神经递质[52-53]。色氨酸是参与控制神经中枢的重要代谢物，可由TPH催化合成重要的神经递质5-HT[54]。本研究结果显示，酸枣仁总皂苷可能通过苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成途径，调控苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等氨基酸及代谢途径的中间产物多巴胺、去甲肾上腺素等神经递质水平改善失眠，进而改善模型动物的学习记忆损伤。
精氨酸与脯氨酸代谢途径是调控学习记忆的重要途径[55]。精氨酸是NO的直接前体，可促进脑内神经元型一氧化氮合酶、c-Fos的表达及新生神经元的生成，增强学习记忆能力。NO作为重要的信号分子，介导、参与学习记忆相关的特定生理过程[56-57]。脯氨酸是组成酪氨酸激酶2（proline-rich tyrosine kinase 2，Pyk2）的重要氨基酸。Pyk2通过激活蛋白酪氨酸激酶通路，增强N-甲基-D-天冬氨酸受体活性，使蛋白质磷酸化增强，促使钙离子大量流入突触后神经元，因而产生较强的兴奋性突触后电位，影响海马突触可塑性，进而改善记忆损伤[58]。
本研究中酸枣仁总皂苷能够显著回调海马组织中NO水平，上调精氨酸和脯氨酸的水平，进而改善失眠引起的记忆损伤。组氨酸代谢途径是维持脑内组胺稳态的重要途径[59]。组氨酸是组胺的前体，组胺是促进觉醒和维持觉醒状态的一种兴奋性神经递质。研究表明，下丘脑后部的结节乳头体核内组胺能神经元具有促进和维持觉醒的作用[60]。组胺也可以通过增强基底核的胆碱能神经的活性，增加海马内胆碱含量而改善认知能力[61]。本研究表明酸枣仁总皂苷可以显著上调海马组织中组氨酸水平，从而改善学习记忆损伤。
综上所述，本研究采用PCPA复制失眠大鼠模型，整合药效学和代谢组学的方法，从整体水平上探讨了酸枣仁总皂苷改善失眠导致学习记忆损伤的作用机制。酸枣仁总皂苷能够显著回调水迷宫行为学指标，改善失眠引起的大鼠记忆损伤，并使海马胞质空泡化损伤恢复，显著上调海马组织中5-HT、GABA、NO水平，进而改善学习记忆损伤。此外，酸枣仁总皂苷能够恢复PCPA引起的海马中氨基酸代谢紊乱和代谢轮廓异常，进而发挥改善学习记忆损伤的作用。
本研究在代谢层面发现调控学习记忆的氨基酸通路，并提供了代谢物类别和相对含量层面的信息。失眠模型动物海马代谢谱的改变对研究失眠模型下的学习记忆损伤过程具有重要价值，但其代表的生物学意义仍需要谨慎解释和验证，需进一步在细胞、蛋白等分子水平上深入研究。本研究将为进一步深入探讨酸枣仁总皂苷改善PCPA失眠大鼠学习记忆提供研究基础，为酸枣仁总皂苷的新药创制研究提供科学参考。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：衡依然，段慧竹，杜 鹤，闫 艳，杜晨晖．酸枣仁总皂苷改善对氯苯丙氨酸诱导失眠大鼠模型学习记忆损伤机制的研究 [J]. 中草药, 2022, 53(21): 6759-6770 .
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