在细胞内核糖核苷三磷酸(rNTP或NTP)量要比脱氧核苷三磷酸 dNTP多得多,两者的比值超过100,并且两种核苷酸底物之间只有1个氧原子差异,因此DNA 聚合酶在催化基因组DNA复制的时候,有时不可避免地会以NTP代替 dNTP参入到子代DNA分子之中。拒估计,大肠杆菌 DNA 聚合酶 III 每复制2.3 kb 的序列会参入1个核糖核苷单磷酸 (rNMP或NMP) ,即每轮复制大约 2 000 个错误的rNMP的参入。 为了保持基因组完整性,大量错误参入的 rNMP 被进化上高度保守的依赖2型核糖核酸酶 H II(RNaseHII) 的核糖核苷酸切除修复(ribonucleotide excision repair,RER) 系统所修复。
无论是细菌,还是古菌或真核生物,体内的核糖核酸酶II都是通过在核糖核苷酸的5' 侧切开DNA主链而启动RER上,随后的核糖核苷由共同构成 RER 途径的其他几种酶催化去除和修复。
然而,关于 RER 的主要未解问题是插入到整个基因组的 单个rNMP 如何在不对 DNA 造成任何重大扭曲的情况下,可以被迅速检测到并与体内的大量典型基因组 DNA 区分开来,即修复系统如何在完整细胞 DNA 碱基代码的“信息海洋”中如此迅速地发现相对罕见的核糖核苷酸损伤。要知道:在呈指数增长的大肠杆菌细胞中,核糖核酸酶II 必须在 30 min的复制周期间隔内识别出数千个基因组 rNMP。 由于核糖核酸酶II 没有内在的运动功能,因此它必须依赖某种形式的随机扩散,这种扩散通常被用来解释 DNA 上的蛋白质运输事件,从而在体外定位其目标。 然而,由于胞内大分子拥挤、DNA 压实和大量非特异性 DNA 结合,这种形式的目标搜索在体内对于低丰度核糖核酸酶II(每个大肠杆菌细胞约50-80 个分子)必须非常低效竞争者(例如,高度丰富的组蛋白样蛋白)在任何给定时刻占据大部分染色体。 考虑到基因组中 rNMP 的随机分布、细胞中核糖核酸酶II分子的稀缺以及运动功能的缺乏,RER 的目标搜索应该仅限于具有前向/后向对称性的“易化”扩散。
在真核和古菌细胞中,与复制机制或增殖细胞核抗原 (PCNA) 的相互作用被认为有助于将核糖核酸酶II递送至其目标,但细菌核糖核酸酶II的“易化”扩散机制一直不很清楚。
现在来自美国🇺🇸纽约大学朗格健康学院生物化学和分子药理学系教授 Evgeny Nudler 博士领导的团队通过研究发现:细菌 RER 是与DNA转录偶联的,即依赖于RNA 聚合酶 (RNAP)来快速定位目标,因此通过催化转录 的RNAP 启用的一维DNA 扫描对于核糖核酸酶II在细菌体内的有效功能十分重要。该研究成果发表在最新一期的Cell上。
正如他们在以前研究中所做的那样,研究人员使用定量质谱法和体内蛋白质-蛋白质交联来绘制化学连接蛋白质之间的距离,从而确定核糖核酸酶II 和 RNA 聚合酶在活细菌细胞中相互作用时的关键表面。 通过这种方式,他们确定大多数核糖核酸酶II分子与 RNA 聚合酶偶联。
此外,他们还使用冷冻电子显微镜(CryoEM) 捕获与 RNA 聚合酶结合的核糖核酸酶II 的高分辨率结构,以揭示定义RER 复合物的蛋白质-蛋白质相互作用。此外,减弱 RNA 聚合酶与RNA聚合酶II 相互作用的结构导向遗传实验会降低 RER的修复效率。
总之,这项工作支持一种模型,在该模型中,核糖核酸酶II在 RNA 聚合酶的帮助下沿着 DNA 移动时扫描 DNA 以寻找错误参入的核糖核苷酸。该模型对于对 DNA 修复过程的基本理解至关重要,并且具有深远的临床意义。
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