玉米甜、糯性状育种的遗传学基础

摘要:甜玉米和糯玉米是一类淀粉合成途径不同、基因发生突变导致子粒中含有高可溶性糖或高支链淀粉的玉米，是可直接食用的鲜食玉米类型。介绍玉米甜、糯性状形成的生物化学基础及其遗传特征，详细阐述单果穗甜糯形成的遗传学基础与机制，利用基因编辑技术进行隐性性状高效遗传改良具有无需表型选择并克服连锁累赘的优势。

甜玉米和糯玉米是一类淀粉合成途径中不同基因发生突变、导致子粒中含有高可溶性糖或高支链淀粉的玉米，是可直接食用的鲜食玉米类型，具有重要的育种与农业生产应用价值。近年来，随着市场对特用型玉米种类需求的多样化，培育不同口感的特用型玉米成为育种新方向。甜糯玉米是一类具有较高甜度同时还具备糯性口感的特质玉米，因其风味独特、营养丰富而市场潜力巨大。近些年，随着对甜糯玉米种质的改良与研究工作投入不断增加，甜糯玉米的育种工作取得了非常大的成就。目前，甜糯玉米种质培育多数为传统育种方法，育种效率较低、耗时长，同时不可避免地产生连锁累赘等问题影响甜糯玉米品质。基因组编辑技术的发展，特别是CRISPR-Cas9技术的出现可有效地解决传统育种的缺陷，提高育种效率，缩短育种周期。本文综述玉米淀粉代谢途径与甜玉米、糯玉米以及甜糯玉米产生的遗传学与生物化学机制，并对基因编辑新技术育种在此领域上的应用进行探讨，为玉米遗传育种的生产提供新的思路。


1玉米淀粉代谢途径与甜糯性状产生的生物化学机制

1.1子粒淀粉代谢合成途径

玉米子粒中淀粉的合成较为复杂，主要涉及3个步骤:1腺苷二磷酸葡萄糖(ADP-Glc)的合成，在胚乳细胞中由叶片等光合组织合成并运送的蔗糖在蔗糖合成酶(Sucrosesynthase，SUS)的催化下，分解为果糖和尿苷二磷酸葡萄糖，尿苷二磷酸葡萄糖在尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的催化下生成1-磷酸葡萄糖，随后，在腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)的作用下生成ADP-Glc，ADP-Glc为淀粉合成的底物;2ADP-Glc的转运过程，ADP-Glc需要一种由Bt1基因编码的腺苷酸转运器将ADP-Glc转移至淀粉体中进行进一步合成淀粉;3直链淀粉和支链淀粉的合成，运送到淀粉体中的ADP-Glc在颗粒结合型淀粉合成酶(GranuleBoundStarchSynthase，GBSSI)的作用下，保持合成的直链淀粉不进行分支形成直链淀粉，在可溶性淀粉合成酶、淀粉分支酶、淀粉脱支酶共同作用形成α-1，6糖苷键，从而形成支链淀粉。

遗传学和生物化学研究已鉴定出玉米中20多个基因参与淀粉合成代谢，其中，6个基因发挥了关键的作用。Bt2、Sh1和Sh2位于上游(图1)，参与不同形式的葡萄糖的合成。高活性Sh1在灌浆方面发挥作用，提供更多的葡萄糖作为底物进入淀粉合成的后续途径。sh2和bt2编码AGPase酶亚基，这个酶是控制淀粉生产中的限速步骤，并通过别构效应剂调节。通过Ae1、Su1和Wx1这些基因编码的酶产生淀粉代谢的最终生成直链淀粉和支链淀粉。

1.2甜玉米子粒性状形成的生物学机制

甜玉米表型是受1个或多个隐性基因共同控制的胚乳突变体，在突变体子粒发育过程中由于蔗糖向淀粉转化的途径受阻，所以子粒中积累了大量糖分，子粒表现出较高的甜度和较低的淀粉含量。甜玉米根据甜质基因的不同可分为普通型甜玉米su1、超甜型玉米sh2、加强型甜玉米su1se。控制甜玉米性状的基因主要包括su1、sh1、sh2、sh4、bt1、bt2等隐性基因，其中，su1控制的普甜性状与sh2控制的超甜性状为甜玉米育种应用的最为广泛的隐性基因。su1突变体干燥的子粒表现为褶皱半透明状态，su1基因位于玉米第4染色体短臂，编码淀粉去分支酶，当su1基因突变淀粉去分支酶在子粒发育过程缺失导致子粒还原性糖含量升高。sh2突变体子粒表现为膨胀和透明，干燥后子粒表现为皱缩易碎。Sh2基因位于第3染色体长臂，基因编码AGPase大亚基，AGPase可催化葡萄糖1磷酸和腺苷三磷酸直接合成ADP-Glc和焦磷酸，当Sh2基因发生突变SH2合成受阻直接导致ADPase活性降低，子粒中淀粉合成受阻淀粉含量下降可溶性糖积累，子粒表现出超甜特性。

1.3糯玉米子粒性状形成的生物学机制

糯玉米又称蜡质玉米，是指玉米子粒成熟后胚乳中支链淀粉含量几乎100%，胚乳呈角质不透明且无光泽的蜡质状，食用时呈黏性故又称粘玉米。糯性玉米独特的性状是由受wx1单基因隐性突变控制的，Wx1基因位于第9染色体短臂，野生型Wx1基因全长3718bp，由14个外显子和13个内含子构成，该基因编码颗粒结合型淀粉合成酶。如果Wx1基因缺失或GBSSI酶活性降低，将导致胚乳以及花粉中直链淀粉含量降低，从而改变淀粉的糊化和膨胀等特性形成具有糯性性状的糯性玉米子粒。


2甜糯玉米的遗传机制

2.1甜糯玉米形成的遗传机制

在代谢途径中，上、下游的基因存在上位性互作，如超甜基因sh2与糯性基因wx1分别控制玉米甜、糯性状，由于sh2基因在淀粉合成途径中位于上游，当sh2隐性纯合时ADPase活力下降，无法合成ADP-Glc，导致直链淀粉与支链淀粉合成受阻，子粒中淀粉含量急剧降低，还原性糖含量升高，即使wx1基因为纯合隐性子粒中也无法表现出糯性性状。只能通过遗传学方法使双隐性或多隐性甜玉米基因(sh2、bt1、su1)与糯玉米基因wx1杂合子后代组配产生显隐性基因分离，从而达到同一果穗上实现一定比例的甜子粒和糯性子粒。九甜粘早玉米粉质∶糯质∶甜质子粒的比例为9∶3∶4，果穗中同时含有糯性子粒与甜玉米子粒。通过不同亲本杂交可获得不同甜糯子粒比例的果穗，以sh2和wx1基因所控制得到的甜糯玉米为例，根据孟德尔遗传定律可得到如下亲本配型(表1)。

2.2从小孢子发育与大孢子发育的机制解释胚乳甜糯相关的基因型

胚珠中的大孢子母细胞经减数分裂产4个单倍体细胞(n)，其中，靠近珠孔的3个细胞退化，只有最深处的l个细胞发育成大孢子(n)，大孢子在胚囊内进行3次有丝分裂形成8个核(n)，他们分别在胚囊的两端，然后两端各移1个核到中央，这2个核就是胚囊中的2个极核(n)，其余6个核分别各自围以细胞质成为细胞，其中，接近珠孔的3个细胞中较大的1个为卵细胞(n)，另2个较小的为助细胞(n)，另一端的3个为反足细胞(n)。因此，被子植物胚囊中的卵与极核是由1个大孢子经过多次有丝分裂形成的。所以，大部分被子植物胚囊中的卵和每一个极核中的基因组成是相同的。

花粉囊里的小孢子母细胞经过减数分裂，形成4个小孢子(n);之后相互分离，成为4个单核的花粉粒;单核花粉粒形成不久，便进行1次有丝分裂，形成2个细胞:一个是营养细胞(n)，一个是生殖细胞(n);生殖细胞接着又进行有丝分裂，形成两个精子(n);当花粉粒落在柱头上，受柱头上黏液的刺激，开始萌发，生出花粉管，花粉管穿过花柱进入子房一直到达胚珠，放出2个精子，其中，1个精子与卵细胞融合形成受精卵发育成2倍体胚，另1个精子与两个极核融合形成受精极核发育成3倍体胚乳(图2)。所以，胚基因型=卵细胞+精子的基因、胚乳基因型=卵细胞+卵细胞+精子基因。


2.3甜糯玉米育种及隐性基因利用在遗传育种上的缺点

目前，玉米育种工作常用传统的回交育种来导入目的基因，然而在传统的回交育种目标基因转移过程中往往导入非轮回亲本上的染色体片段，这些片段携带有不利基因，不利基因与目标基因紧密连锁，从而造成育种目标与预期结果不一致。甜糯玉米种质培育多数为传统育种方法，在传统的回交育种过程中，目标基因的转移往往带入了非轮回亲本上的染色体片段，影响育种效率。另外，包括wx1和sh2在内的几乎所有的相关基因都涉及隐性基因的育种应用，育种过程中杂合个体隐性基因往往被显性基因掩盖，无法通过表型直接选择基因型，需经过自交纯合后才能显现出来。因此，常规育种利用隐性基因的时间通常是显性基因的两倍，延长了育种周期。


3基因编辑技术的原理及其育种应用

3.1基因编辑技术原理

基因组编辑是可以诱变、插入、删除和替换DNA序列的一种方法，可以实现基因敲除、基因增加和基因修复等功能。基因组编辑包含两个基本步骤:第一，核酸酶切割预期的DNA序列位点，产生DNA双链断裂DSB;第二，细胞利用非同源末端连接NHEJ或同源重组HR等方式修复DSB，对特异基因组位点进行修饰。CRISPR-Cas9(Clusteredregu⁃larlyinterspacedshortpalindromicrepeats)是基因组编辑领域重要的突破。在Cas9DNA切割酶与sgRNA(SmallguidanceRNA)的共同作用下，定点基因组改变的难度显著降低。基于CRISPR-Cas9技术原理，在目标基因中搜寻所有潜在的sgRNA识别位点G(N20)GG的序列作为潜在的突变位点，设计sgRNA序列，sgRNA与CRISPR-Cas9蛋白结合便可以对含有目标片段的靶基因进行切割。通过NHEJ或HR等形式引入突变，达到对目标基因的编辑。

3.2基因编辑技术在甜糯玉米育种生产原理及其优势

通过基因编辑技术将基因编辑元件转入受体材料，表达出编辑复合物对其他基因座上的目标靶标基因进行定点修饰。修饰后的靶标基因的遗传背景没有变化，因此没有连锁累赘。此外，利用基因敲除将目标基因定点定向突变成隐性基因，克服了隐性基因育种应用的缺点。转入的基因编辑元件通过杂交过程中的分离，即可分离出不含该元件的育种材料或亲本。CRISPR-Cas9定点突变技术具有设计简单、较高的突变概率，且CRISPR-Cas9基因编辑系统对子代基因组具有持续编辑能力等优点，可尝试用于玉米育种工作。
基于CRISPR-Cas9定点突变技术的甜糯玉米育种技术，将设计好的CRISPR-Cas9编辑载体转入转基因材料，对材料的Sh2和Wx1基因进行定点突变形成定点突变材料。当定点突变材料与育种受体材料杂交时，由于定点突变材料中含有转基因成分CRISPR-Cas9系统，该系统可高效地将新引入的育种受体材料中甜、糯的显性基因Sh2和Wx1定点突变成糯性隐性基因sh2和wx1，由于受体材料中的隐性基因是通过基因编辑技术直接突变得来，而非经过回交重组得到的无连锁累赘，遗传背景经过数代回交即可恢复。转入的基因编辑元件在回交过程中即可分离出不含该元件的育种材料或亲本，亲本遗传背景恢复快。未来可以进一步加快甜糯等玉米性状的遗传改良。


4基因编辑技术在玉米遗传育种改良中的应用及其前景

包括控制甜、糯性状在内的几乎所有特用玉米的相关基因都涉及隐性基因的育种应用，然而由于显性基因的掩盖，无法通过表型直接选择基因型，需经过自交纯合后才能显现出来。此外，在传统的回交育种过程中，由于连锁累赘等因素制约着育种效果和效率。

基因编辑技术的出现可有效地解决传统育种中隐性基因育种方法的缺点。通过基因编辑技术将基因编辑元件转入受体材料，表达出编辑复合物对其他基因座上的目标靶标基因进行定点修饰。修饰后的靶标基因的遗传背景不变无连锁累赘。利用基因敲除将目标基因定点定向突变成隐性基因，在BC2代自交即可得到高背景恢复，与传统导入隐性基因的方法相比，缩短了育种周期，提高了效率。中国农业科学院作物科学研究所谢传晓研究小组利用CRISPR-Cas9基因编辑技术应用于玉米株型、育性、产量与品质等重要性状种质的创制，其中糯性突变体(专利申请号:201610060095.5)已经开放合作。

长期以来，我国玉米育种主要依赖于常规育种技术，种质资源匮乏、育种效率低、育种周期长、种质创新与技术相对落后等诸多因素限制着我国玉米种业的发展。近年来，基因组编辑技术特别是CRIS⁃PR-Cas9技术在玉米中成功的应用对促进玉米分子遗传改良具有重要的意义。

 

来源：《玉米科学》 2017，25(2):1~5