疫病是外感疫疠邪气引起的一类急性烈性传染性疾病的总称[1]。中医学认为瘟疫的病因是疫毒，与“非时暴寒”“非节之气”密切相关，多认为是受到“时行乖戾之气”，也就是带有致病因素不正常的邪气伤害所致。疫病流行时期，历朝医家积极探寻治疗之法，逐步形成了理论相对完整、技术手段丰富的疫病防治体系[2]。东汉著名医家医圣——张仲景，是辨证论治方法的始祖与其临床应用的奠基人，善治因寒而发热的外感病，理法方药齐备，后世研究者代不乏人。他编著的《伤寒杂病论》不仅为外感疾病治疗提供方法，而且在中医辨证论治方面提供了范例，是理论与临床实践结合的典范。
《伤寒杂病论》由王叔和收集整理，其中《伤寒论》是张仲景在辨证论治的基础上总结前世医家学术观点及自身临床经验的结合，对外感伤寒的发生、发展及传变规律进行了全面分析[3]，后世誉之为“方书之祖”[4]。《伤寒论》为中医药治疗疫病水平的提升做出了很大贡献，也是研究早期发热性传染病的经典文献。回顾我国古代抗击疫情的历史，中医药抗疫历史经验弥足珍贵[2]。纵观现代医学，中医药抗疫仍在发挥其独特的作用。
新型冠状病毒肺炎（COVID-19）是一种以发热、干咳、乏力为主要表现的急性呼吸道传染病，部分患者还有鼻塞、流涕、咽痛、嗅觉味觉减退或丧失等表现[5]。国家卫健委等多级主管部门陆续出台多版诊疗及预防方案[6-7]。其中明确指出了疑似病例与确诊病例的诊断标准，主要是根据流行病学史来判断，其临床表现包括①发热和（或）呼吸道症状等COVID-19相关临床表现；②具有COVID-19影像学特征；③发病早期白细胞总数正常或降低，淋巴细胞计数正常或减少。
确诊病例为在疑似病例中具备以下病原学或血清学证据之一者：①新型冠状病毒核酸检测阳性；②未接种新型冠状病毒疫苗者新型冠状病毒特异性免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）抗体和IgG抗体均为阳性[6-7]。随着对COVID-19的认识深入和临床经验的积累，中医从抗疫的参与者逐渐成为主力军[8]。中医药抗击COVID-19疫情的典型代表“三药三方”中的清肺排毒汤正是由小柴胡汤与麻杏石甘汤、射干麻黄汤、五苓散合方而成[9]，其中小柴胡汤也作为基本方被各地多部门推荐使用[8-9]，可见《伤寒论》中古方在当今新病治疗中正发挥重要作用。
本研究筛选疫病相关篇幅收录的方剂，运用R语言（4.1.2）、IBM SPSS statistics 22、IBM SPSS Modeler 18.0、Neo4j Desktop与Cytoscape 3.6.0等软件进行数据挖掘，探索其用药组方规律，以期为COVID-19预防与治疗、新方发现与古方新用提供参考。
从《伤寒论》中治疫方剂可看出，此时期治疫病多以“清、下”之法为主，承气汤、白虎汤、茵陈蒿汤等为其治疫代表方剂；以温中解表、和解少阳为辅，理中汤、四逆汤、大小柴胡汤为其代表方剂。而《温病学》中将瘟疫划分为温、燥、寒、湿等不同性质，首要特征为强烈的传染性，根据其病性和阶段来辨证治疗[10]。《伤寒论》中的伤寒为广义的伤寒，即一切感受外邪所发疾病，不论寒热。在《温病学》中，狭义的伤寒定义为感受寒邪而发病，治法当以散寒解表为主。《伤寒论》中治霍乱以温中之法为主，代表方剂有四逆汤、桂枝汤等；治疟以清湿热为主，代表方剂为茵陈蒿汤[11]。而在《温病学》中，治霍乱祛湿为首要治法，同时兼顾恢复脾胃升降之功能，代表方剂为蚕矢汤、藿香正气散等；治疟以祛邪截疟为基本治则，代表方剂为达原饮。
本研究根据纳入与排除标准对《伤寒论》中治疗疫病的方剂进行筛选，最终共摘录相关方剂61首。其中卷第五辨阳明病脉证并治第八方剂19首，卷第五辨少阳病脉证并治第九方剂1首，卷第七辨霍乱病脉证并治第十三方剂6首，卷第七辨阴阳易差后劳复病脉证并治第十四方剂5首，卷第八辨发汗后病脉证并治第十七方剂22首，卷第九辨可下病脉证并治第二十一方剂8首。记录各处方的名称、组成、剂量等基本信息。
以中医疫病诊断标准为基础，即发病特点有强烈的传染性、易发生流行，“起病急骤初起可见憎寒壮热继则但热不寒，苔白如积粉舌质红绛或身大热头痛如劈吐泻腹痛或吐衄发斑舌绛苔焦脉浮大而数等”。传变迅速、症状复杂、病情凶险，可在短时间内出现热陷心包、伤络动血、厥脱、尿闭等危重证候[11]。COVID-19以发热、乏力、干咳为主要表现，少数患者伴有鼻塞流涕、咽痛和腹泻等症状，具有流行性、传染性。病位主要在肺，可波及五脏，病机以“寒、湿、热、毒、瘀、虚”为主，初期多寒湿，可入里化热，后期多气阴两虚[12]。
针对病因病机，各期治疗均以祛邪解毒为核心，根据病程发展的阶段性，治疗时应将病情轻重、病程分期与中医证候相结合。结合现代辨证思路，以“伤寒”“霍乱”“疟”等为搜索词在《伤寒论》中进行检索，确定了阳明病、少阳病、霍乱、劳复等与疫病相关疾病，纳入①符合疫病中医诊断标准的治疗方，且为有效的方剂；②主治中有明确的与疫病相关的症状描述；③具有齐全的方剂名称。
①不可独立使用的处方；②单味中药处方；③方药缺失或组方不明确的方剂。
由双人将符合上述条件的方药录入Excel 2016软件，异议处理由具有中医背景的第3人进行判断。数据规范方面，将姜、枣、葱等药引纳入到药物组成，按照《中国药典》2020年版[13]和《中药学》2016年版教材[14]，对61首方药的处方组成进行标准化处理。例如，将茵陈蒿统一规范为茵陈，商陆根统一规范为商陆，生梓白皮统一规范为梓白皮等。药物性味等属性同样参考《中药学》2016年教材[14]。数据录入与规范化完成后，由第3人再次进行审核，确保数据规范的准确性。本研究分别运用R语言（4.1.2）、IBM SPSS statistics 22、IBM SPSS Modeler 18.0、Neo4j Desktop与Cytoscape 3.6.0将规范后的数据进行处理与分析。
在R语言处理阶段，将规范化后的数据库保存为csv文件，导入R软件进行高频中药分析、关联规则分析与可视化处理。在SPSS处理阶段，运用Excel中数据透视表功能将规范后的中药进行二分类变量处理，以方药编号为行名，中药名称为列名，建立事务型数据库。接着导入IBM SPSS statistics 22，进行系统聚类分析。在SPSS Modeler处理阶段，将事务型数据库直接导入软件，对张仲景《伤寒论》中疫病治疗前20味高频中药聚类进行可视化分析，绘制高频中药网络图。高频中药的性味归经分析皆在Excel 2016中完成。在Neo4j处理阶段，将高频中药与其性味归经的关系用表格分别建立一一对应关系，并保存为csv文件，导入到Neo4j中，使用create语句建立结点，match语句建立关系，将其进行可视化。
结合“1.4”项中用药规律分析结果得到的核心药物，通过TCMSP[15]平台（http://tcmspw.com/tcmsp. php）搜集核心药对的化学成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug-likeness，DL）≥0.18筛选各成分靶点，同时筛去无对应靶点的成分，将靶点导入Uniprot[16]数据库（http://www.unitprot.org/）剔除非人类的靶点蛋白，确定中药的活性成分及其对应基因靶点。在Genecards（
https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/）、Drugbank（https://www. drugbank.com/）数据库中以“novel coronavirus pneumonia”为关键词检索与COVID-19相关的基因，整理并去重之后得到COVID-19相关靶点数据集。
将药物有效成分的靶点与疾病相关靶点利用R Studio取交集靶点，获得药物疾病直接关联的关键靶点。在Cytoscape V3.6.0中以疾病、核心药物、有效成分和交集靶点为节点，边为相互之间关系，构建“疾病-药物-成分-靶点”关系网络。将关键基因靶点输入String[17]数据库中，选中物种为“人”，评分条件＞0.90，获取蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络，并将得到的数据导入Cytoscape进行可视化。利用R Studio 4.1.2中的“clusterProfiler”包对疾病-药物交集靶点进行基因本体论（gene ontology，GO）功能分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。
运用R语言对《伤寒论》中疫病防治61首相关方药进行中药频次分析。共包含52味中药，总使用频次275次。如表1所示，使用频次≥15的有4味，使用频次介于10～15的有3味，使用频次介于5～10的有15味，其余中药的使用频次均在5次以下，占全部中药的57.69%。
另外，使用频次最高的前20味中药（单味中药在61首方剂中出现的频率）分别是甘草（37次）、生姜（18次）、大枣（16次）、桂枝（16次）、大黄（14次）、人参（14次）、白芍（13次）、半夏（9次）、干姜（9次）、枳实（9次）、附子（8次）、茯苓（7次）、厚朴（7次）、黄芩（7次）、白术（6次）、柴胡（6次）、苦杏仁（6次）、芒硝（6次）、麻黄（5次）、石膏（5次），见图1。
《伤寒论》中高频中药药性包含平、温、寒等7种，其中占比最高的为温性药物，为35%，其次为寒性药物和微寒性药物，占比均为15%。高频中药药性频次和占比如表2所示。
《伤寒论》高频中药药性知识图谱见图2，其中绿色节点表示医家即张仲景，灰色节点表示中药实体即《伤寒论》疫病相关药方中前20味高频中药，褐色节点表示药性实体。连接中药实体与药性实体之间的边表示这些药相应的性。通过该图谱，可以得知，高频中药中，药性占比最高的温性药物有大枣、桂枝、白术、半夏、麻黄、生姜、厚朴。
《伤寒论》中高频中药药味包含甘、辛、苦、微苦、酸、淡、咸7种，其中占比最高的为辛味药物，为30.30%；其次为苦味药物，占比27.27%；排名第3的为甘味药物，占比24.24%。高频中药药味频次和占比如表2所示。
《伤寒论》高频中药药味知识图谱见图3。其中绿色节点表示医家即张仲景，灰色节点表示中药实体即《伤寒论》疫病相关药方中前20味高频中药，粉色节点表示药味实体。连接中药实体与药味实体之间的边表示这些药相应的味。通过该图谱，可以直观地看到，高频中药中，药味占比较高的有辛、苦、甘，占比最高的辛味中药为生姜、桂枝、半夏、柴胡、麻黄等。
《伤寒论》中高频中药归经包含心经、肺经、胃经、脾经等11种，其中脾经占比最高，为21.88%，肺经和胃经占比也较高，小肠经和心包经占比最低。高频中药归经频次和占比如表2所示。
《伤寒论》高频中药归经知识图谱见图4。其中绿色节点表示医家即张仲景，灰色节点表示中药实体即《伤寒论》疫病相关药方中前20味高频中药，紫色节点表示归经实体。连接中药实体与归经实体之间的边表示这些药相应的归经。可以直观地看到，高频中药中，归经为脾、肺、胃、心经的中药较多，归经为心包、小肠、膀胱、胆、肝、肾、大肠经的中药较少。
如表3所示，《伤寒论》高频中药功效占比最高的是补气药，占比为20%，其次为发散风寒，占比为15%，攻下和温里占比均为10%。其余功效占比均为5%。
《伤寒论》高频中药功效知识图谱见图5。其中绿色节点表示医家即张仲景，灰色节点表示中药实体即《伤寒论》疫病相关药方中前20味高频中药，红色节点表示功效实体。连接中药实体与功效实体之间的边表示这些药相应的功效。可以直观地看出，《伤寒论》中，功效占比最多的补气药有甘草、人参等；功效占比其次的发散风寒药有麻黄、桂枝等；攻下药为芒硝和大黄，温里药为附子和干姜。
对《伤寒论》中使用前20的高频用药进行Pearson相关性分析，并使用R Studio中Corrplot函数将高频中药相关性分析进行可视化，见图6。
根据Pearson相关系数大小对药对组合进行排列，相关系数较高的前10组药对见表4。由表4可知，黄芩-柴胡相关性最强，相关系数为0.92，接近于1.00。
使用R Studio对《伤寒论》疫病防治用药进行关联规则分析，根据方剂数量为61首，同时结合经验判断和不同参数提取出数据的预读，设置最小支持度为7%，最小置信度为60%，共得到《伤寒论》疫病防治用药的271条关联规则，包含40条二阶关联规则，94条三阶关联规则，91条四阶关联规则，40条五阶关联规则，皆是提升度＞1的有效规则。按置信度及提升度降序排序，前20条关联规则如表5所示。
运用IBM SPSS statistics对《伤寒论》疫病治疗用药前20味高频中药进行了系统聚类分析，生成了系统距聚类树，见图7。由图7可知，《伤寒论》疫病治疗用药前20味高频中药可以分为特征相近的5类。类聚方1：黄芩、柴胡、半夏、生姜、大枣、人参、桂枝、白芍；类聚方2：干姜、附子、甘草；类聚方3：苦杏仁、麻黄、石膏；类聚方4：茯苓、白术；类聚方5：枳实、厚朴、大黄、芒硝。其分别为小柴胡汤加减、四逆汤、麻杏石甘汤加减、茯苓白术汤、大承气汤等方中主要药物。
中医药有着几千年与瘟疫做斗争的历史，在此次COVID-19疫情防控中作用重大。从国家及各省市诊疗方案和中医临床专家的见解中发现[18]，尽管方药多有差异，但COVID-19属于中医“疫”的范畴，经口鼻、接触而传染发病，其毒与寒湿燥之邪相合，首先上受犯肺，病位以肺为中心，病机以“湿邪”为主，其核心证型为“痰热壅肺、闭肺”“风寒、风热犯肺”等[19]。COVID-19患者最常见的症状是发热和咳嗽，部分患者出现发热持续反复波动的情况，《伤寒论》中记载：“往来寒热，胸胁苦满，默默不欲饮食，心烦喜呕，或胸中烦而不呕……小柴胡汤主之”，这与小柴胡汤适应证相符[9]。
类聚方中出自《伤寒论》中的方剂有小柴胡汤、麻杏石甘汤和大承气汤等。大承气汤主要用于泻下，小柴胡汤和麻杏石甘汤与疫病的相关性较强，同时结合相关分析结果，“柴胡-黄芩”为相关系数最高的药对，并且其在关联规则分析中的支持度（9.84%）、置信度（100%）和提升度（8.71）均较高，该药对是出自《伤寒论》的经典名方小柴胡汤，因此本研究选择小柴胡汤为例，构建其“病-证-症-方-药”关系，并对其核心药对进行作用机制研究。
从录入的61条数据中，筛选出使用小柴胡汤治疗的条目，共3条。其中症状按照《中医症状鉴别诊断学》第2版进行人工分词和规范化，规范化例如“往来寒热”规范为“寒热往来”；对于一些《伤寒论》中原始提出的症状，如“胸胁满”一类的词保留。运用Neo4j Desktop软件分别建立疾病、证候、症状、方剂、中药5个结点，并建立“病-证”“证-症”“症-方”“方-药”4种关系，最终得到如图8所示的“病-证-症-方-药”关系。
在目前COVID-19的治疗中，清肺排毒汤被广泛运用，而其组成成分之一正是小柴胡汤。同时，小柴胡汤也被多地、多部门联袂推荐使用[8-9]，可见仲景古方在治疗新疫病中正发挥重要作用，但是对于其作用机制的研究仍有不足。小柴胡汤中柴胡为君，黄芩为臣，“柴胡-黄芩”为其核心药对。同时，柴胡与黄芩的配伍首现于《伤寒论》，是仲景柴胡系列方剂中最具代性的基本配伍，也是本研究挖掘张仲景治疗疫病方剂中相关程度最强的配伍药对，且为临床常用药对。
柴胡微寒，归肝、胆、肺经，主要有疏散退热、化解肝郁作用；黄芩苦寒，归肺、胆、脾经等，主要功效为清热燥湿、清肺止咳、泻火解毒、止血等。该药对广泛运用于心血管系统、消化系统、呼吸系统等疾病，并且疗效显著。故本研究选择核心药对“柴胡-黄芩”进行作用机制研究。3.2.1 “柴胡-黄芩”药对活性成分筛选 通过TCMSP数据库检索“柴胡-黄芩”有效成分及基因靶点，最终筛选出主要活性成分柴胡13个，黄芩32个，共同有效成分有1个，为豆甾醇（stigmasterol），去除重复靶点后共得到189个靶点。主要活性成分信息见表6。
GeneCards检索得到1043个基因，通过相关度大于中位数规则筛选出522个疾病靶点；OMIM和Drugbank分别得到2、26个靶点。整理上述靶点共获得COVID-19靶点543个。
利用R Studio的ggvenn包取药物及疾病靶点的交集，共得到64个交集靶点，如图9所示。
为直观展现64个“柴胡-黄芩”药对治疗COVID-19的相互作用关系，利用Cytoscape构建“疾病-药物-成分-靶点”网络，见图10。其中度（degree）＞10的化合物编号分别为CH10、HQ2、CH5、HQ4、HQ1、HQ28、HQ13、HQ15、HQ16；同时度＞17的核心靶点为前列腺素内过氧化物合成酶2（PTGS2）、热休克蛋白90α（HSP90AA1）、雄激素受体（AR）、诱导型一氧化氮合成酶2（NOS2）、蛋白激酶环腺苷酸（cAMP）激活催化亚基α（PRKACA）、二肽基肽酶4（DPP4）。
将64个关键靶点输入String平台，并利用Cytoscape绘制PPI网络，评分条件＞0.40，共有64个节点，1069条边，平均节点评分为33.4，见图11。其中得分排名前25的是血管内皮生长因子A（VEGFA）、肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤抑制蛋白（TP53）、蛋白激酶Bα（AKT1）、白细胞介素-1β（IL1B）、半胱氨酸蛋白酶-3（CASP3）、白细胞介素-8（CXCL8）、PTGS2、缺氧诱导因子-1α（HIF1A）、IL-10、表皮生长因子（EGFR）、脑区原癌基因蛋白（FOS）、趋化因子配体2（CCL2）、细胞间黏附分子1（ICAM1）、G1/S-特异性周期蛋白-D1（CCND1）、核因子-κB抑制因子α（NFKBIA）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）、血红素加氧酶1（HMOX1）、HSP90AA1、II型干扰素（IFNG）、CASP8、B-细胞淋巴瘤因子2样蛋白1（BCL2L1）、转录因子p65（RELA）、IL-2。
利用R语言对64个关键靶点进行GO和KEGG通路分析，限定P＜0.05，绘制气泡图和条形图，由图12可知，GO生物过程主要包括对脂多糖的反应（response to lipopolysaccharide）、细菌源性分子的反应（response to molecule of bacterial origin）、细胞对生物刺激的反应（cellular response to biotic stimulu）、细胞对脂多糖的应答（cellular response to lipopolysaccharide）、细胞对细菌来源分子的反应（cellular response to molecule of bacterial origin）等；
GO细胞过程主要包括膜筏（membrane raft）、膜微结构域（membrane microdomain）、质膜筏（plasma membrane raft）、陷窝（caveola）、器官外膜（organelle outer membrane）；GO分子功能以细胞因子受体结合（cytokine receptor binding）、细胞因子活性（cytokine activity）、受体配体活性（receptor ligand activity）、信号受体激活剂活性（signaling receptor activator activity）为主。
KEGG富集通路分析得到165条结果，由图13可知，靶点主要集中在脂质与动脉粥样硬化（lipid and atherosclerosis）、白细胞介素17信号通路（IL-17 signaling pathway）、糖尿病并发症的物及其受体信号通路（AGE-RAGE signaling pathway indiabetic complications）、流体切应力和动脉粥样硬化信号通路（fluid shear stress andatherosclerosis）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、人类巨细胞病毒感染（human cytomegalovirus infection）、Toll受体信号通路（Toll-like receptor signaling pathway）、coronavirus disease-COVID-19、Th17细胞分化（Th17 cell differentiation）等通路。
COVID-19属于中医学中的“疫病”范畴，COVID-19患者所表现出的症状与肺系疫病相似，中医药在与“疫病”长期的斗争过程中积累了较为清楚的认识和丰富的经验，有一套较为完整的理论与临床治疗的方法[20]。《伤寒论》主要论述伤寒病，伤于寒为主而致外感热病的过程即为伤寒，张仲景对伤寒病运用“三阳三阴”为主的六经辨证方法，实质上指根据经脉所属五脏六腑的病理变化，结合相对应临床证候的部位、性质、病机、病势进行分类，从而归纳为六经病证。
《伤寒论》方剂用药精确，加减灵活，临床疗效显著。本研究选取《伤寒论》卷第五、卷第七、卷第八和卷第九中疫病相关方剂61首，进行药物频次、性味归经功效、相关分析、关联规则和聚类分析，挖掘出了相关疫病治疗配伍规律，并对小柴胡汤进行了“病-证-症-方-药”关系构建，以及核心药对“柴胡-黄芩”进行了网络药理学作用机制分析，以期为COVID-19临床治疗提供参考。
《伤寒论》中疫病治疗使用频数最高的4味药甘草、生姜、大枣、桂枝即为桂枝汤组方成分，白芍也位列高频用药第7味。桂枝温通营气、解肌祛风，配伍甘草可辛甘化阳；生姜配伍桂枝散邪；大枣与芍药配伍养阴，配生姜以鼓气血营卫御外邪。桂枝汤目前临床上应用于循环、免疫等多个系统，可达到抗炎、免疫调节、抗菌、抗病毒等效果[21]。
不仅如此，前20味高频用药中包含了甘草、生姜、桂枝、半夏、枳实、茯苓、黄芩、白术、柴胡、苦杏仁、麻黄、石膏（图1），这与《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第九版）》[6]中清肺排毒汤处方中主要成分基本吻合，适用于COVID-19轻型、普通型、重型患者。高频中药中甘草、生姜、大枣、桂枝、大黄、人参、白芍等结果与刘永瑞等[4]的研究结果相似。甘草属于补虚药，在方剂中应用广泛，可以发挥补、缓、护、化、解等功效，这也反映了张仲景温补脾胃的学术思想。
从中药性味归经分析来看，《伤寒论》中用药最偏好温性药（表2）。20味高频中药以温热药为主，频数为11，占比高达55%，寒凉药频数为7，占比为35%。可见张仲景疫病用药善用温性药散寒、温里、助阳，用于外寒、内寒引起的疫病均疗效显著，符合其“重阳气”的思想。此外，其中寒性药也占到了35%，寒温并用，寒以清热，温则驱寒调脾胃。《伤寒论》治疗疫病的前20味高频药物五味中辛、苦、甘排前3位（表2），分别占比30.3%、27.27%、24.24%。
辛可发散解表；苦可清热泻火、清热燥湿；甘可补益和中、调和药性。与药性结合分析，仲景善用辛温、苦温、甘温药物，辛温可发散风寒，苦温可燥湿，甘温可补中益气[20]。高频用药中14味归经于脾（21.88%），其次归于肺经药物13味（20.31%），主归于脾、肺经与COVID-19病位属肺相符合[22]。脾主运化，乃气血生化之源，健脾则能保护五脏，扶脾从而保肺。肺主气，可以促进血行，抵抗外邪，其中卫气防御作用显著；肺主宣散卫气，且肺为娇脏，不耐风寒湿诸邪侵袭，为疫病的病理发展提供了基础。张仲景治疗疫病注重脾肺功能，配伍药物内外兼续，谨守病机，在外发散风寒调和营卫以治肺，在内温补脾胃，燥湿行气，标本兼顾[20]。
从中药功效分类来看，《伤寒论》治疗疫病常用补气药、发散风寒药、攻下和温里药（表3）。补气药及发散风寒药在仲景方中应用广泛，合用既温通经脉，又解表散邪气，在张仲景治疗伤寒时注重护胃气、扶正气，而补虚和中之药可为治疗伤寒之首要辅助用药。
相关性分析中相关系数较高的前10味药对组合多为发散风寒药和清热燥湿药，其中相关系数大于0.9的药对为“柴胡-黄芩”“苦杏仁-麻黄”。柴胡与黄芩是中医临床常见的药对，在小柴胡汤等经典方剂中配伍应用，配伍可消减郁热、清热燥湿、调和表里、和解少阳[23]。“苦杏仁-麻黄”药对，二者皆可入肺，配伍宣降相宜，可辛温发散、宣肺降气平喘，许多经典名方均有此配伍，如三拗汤、麻黄汤、麻杏石甘汤等[24]。
在关联规则分析中，《伤寒论》中治疗疫病2种、3种、4种和5种药物关联规则中置信度与提升度最高的药对组合为“甘草、苦杏仁→麻黄”，其为麻黄汤的主要组成部分，在《伤寒论》中麻黄汤可治风寒表实之证，主要用于发汗解表、平喘止咳。其次为以“柴胡-黄芩”为核心的药对组合，与它们组合的大枣、生姜、半夏正是小柴胡汤的主要成分。小柴胡汤是和解剂，其具有和解少阳的功效。临床主要用于治疗身体出现的伤寒少阳病证。关联规则中排名靠前的2阶组合为“麻黄→苦杏仁”“柴胡→黄芩”，这与相关性分析的结果一致，2组药对的相关系数最高且都大于0.9。
根据中医理论和统计学知识得到5个类聚方。
由黄芩、柴胡、半夏、生姜、大枣、人参、桂枝、白芍组成，此方为小柴胡汤加减，具有和解表里、疏利枢机的功效。COVID-19为湿毒所致，容易肺气郁闭，出现胸闷喘促、气机不利等症状[25]，因此，及时化湿理气、调畅气机、防止气阻闭肺在新冠的救治过程中极为重要，柴胡化解湿气、调和郁热，黄芩清热燥湿。
COVID-19之寒湿疫毒郁于膜原，致少阳枢机不利。少阳乃是太阳、阳明升降的枢纽，可调节三阳经气升降。小柴胡汤中柴胡、黄芩、桂枝、半夏作为主药，具有两解少阳、太阳之邪的作用，为一类；人参、白芍等补益药物为一类；生姜、大枣调和营卫、护卫脾胃，为一类。方中柴胡、黄芩配伍以清泄少阳郁火；半夏、生姜配伍以化痰止呕逐邪，全方疏利少阳、调节枢机，为和解良方。桂枝作为君药，散在表之邪；白芍与人参一样，作为臣药，具有补益之功，同时与桂枝相合，调和营卫，以助疏散表邪[26]。
其中“黄芩-柴胡”药对在相关性分析中得分最高为0.92，相关程度最强；“半夏-黄芩”“生姜-大枣”“半夏-柴胡”位列3～5位，得分均较高，相关程度较强；除此之外，“大枣-黄芩”“生姜-黄芩”也在相关分析排序中位列前10。可见小柴胡汤药物配伍相关程度高。在关联规则分析中，“黄芩-半夏”“黄芩-生姜”“黄芩-大枣”“柴胡-黄芩”药对置信度均为100%，且支持度较高；此外“生姜-大枣”药对的支持度最高且置信度也大于90%，可见小柴胡汤药物配伍相关程度高。
由干姜、附子、甘草组成，乃四逆汤，有温阳散寒、回阳通脉、温肺消痰的功效，为回阳救逆之要方[27]。其中附子干姜味辛，性温热，主风寒咳逆，主治外感、杂病、属脾肾阳虚寒盛者。
由苦杏仁、麻黄、石膏组成，为麻杏石甘汤主要成分。仝小林院士等[25]认为此次COVID-19疫情，系有寒湿化热，毒热郁闭肺气，肺气失于宣降，或热毒炽盛，为肺热不清之证。麻杏石甘汤对外感发热肺热证疗效显著，可用于倾泻肺经实热，辛凉宣泄、清肺平喘，可以缓解发热、抗炎、抗病毒和舒缓喘咳。以麻杏石甘汤作为基础方加减联合基础治疗，对呼吸道感染发热类疾病效果较好[28]。麻杏石甘汤治疗疫病咳痰喘嗽、痰饮聚肺、气滞血瘀等症状，具有清降肺气、辛泄寒气、泻肺排毒的作用。
在相关性分析中，麻杏石甘汤中主要配伍药对苦杏仁-麻黄排名第2，得分为0.9，相关性很强，关联规则分析中“苦杏仁-麻黄”药对的置信度为100%，提升度（10.17）最高，支持度较高，可见该药对关联性很强，为经典配伍。此外，麻黄-甘草、石膏-甘草药对的置信度也为100%，支持度也较高。
由茯苓、白术组成，为茯苓白术汤主要成分，茯苓甘淡性平，归经于心、肺、脾、肾，可泄湿健脾；白术苦甘性温，可健脾益气、固表止汗。茯苓、白术合用通阳利水、健脾而除湿。
由枳实、厚朴、大黄、芒硝组成，乃大承气汤中主要配伍成分，枳实归经于脾、胃、大肠，可消积、化痰、除痞。大柴胡汤中仲景将枳实与大黄配伍应用，取其“消胀满，心下急痞痛”的功效，可用枳实消积除满。厚朴有燥湿消痰、平喘的功效。大黄为寒性药物，有清热泻火、凉血解毒之功效，发挥泄热通腑、活血化疲、安和五脏等作用。芒硝也为寒性药物，软坚润燥、泄下通便。芒硝与大黄同属于泄下药，但芒硝攻积泄热之力较弱而软化燥屎的作用较强，因此广泛用于正气不足或壅滞较轻者。此类聚方配伍以增强泻下攻积之力，用治阳明腑实证、胃肠燥热证等。
本研究基于网络药理学方法[29]研究《伤寒论》治疫方中核心药对“柴胡-黄芩”治疗COVID-19的作用机制，构建“疾病-药物-成分-靶点”网络，并分析其重要活性成分、靶点、蛋白作用、通路等，获取了核心药物45个活性成分和189个作用靶点，COVID-19的543个靶点，交集靶点64个，GO分析1871个相关条目，KEGG共获得164条通路。
4.4.1 “柴胡-黄芩”药对核心成分分析
利用网络药理学的方法构建“疾病-药物-成分-靶点”，得到柴胡-黄芩药对治疗COVID-19可能的重要成分为槲皮素（quercetin）、汉黄芩素（wogonin）、山柰酚（kaempferol）、黄芩素（baicalein）、刺槐素（acacetin）、苏荠黄酮（moslosooflavone）、千层纸素A（oroxylin A）、5,7,4'-三羟基-8-甲氧基黄酮（5,7,4'
-trihydroxy-8-methoxyflavone）、红花素（carthamidin）等。
其中槲皮素、山柰酚、刺槐素是具有生物活性的黄酮类化合物，能够抗氧化、抗病毒、免疫调节和抗炎[30-31]。药理实验表明槲皮素、黄芩素、汉黄芩素均可降低流感病毒感染小鼠死亡率和肺指数，可抑制病毒复制、肺部炎症，保护肺部功能[14]。实验研究表明，槲皮素可以显著增强环磷酰胺造成的免疫低下小鼠的免疫功能[32]，汉黄芩素可通过增加免疫细胞的浸润、调节免疫细胞的表型来增强免疫功能[33]。
刺槐素可通过抗炎、抗氧化等方面干预COVID-19病程进展，显著减轻肺损伤[34]。张英睿等[35]研究表明刺槐素、丁香苷等可作用于CASP3、CASP8等靶点调节细胞凋亡通路及TNF通路，从而对抗COVID-19药物潜在靶点产生作用。陈桂荣等[36]研究表明苏荠黄酮能通过调控PTGS2、NOS2等减少炎症，为防治COVID-19患者脓毒症并发症奠定基础；千层纸素A生物活性强，在神经保护、抗炎、保护血管内皮细胞等方面发挥重大作用。
结合“疾病-药物-成分-靶点”网络高频靶点以及蛋白相互作用网络评分得到可能的重要作用靶点是VEGFA、TNF、IL6、TP53、AKT1、CASP3、CXCL8、PTGS2、EGFR、PPARG、HSP90AA1、IL10、IL2、NOS2、NOS3、糖原合酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3 beta，GSK3B）、促分裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14）等。
其中PTGS2、HSP90AA1、NOS2、IL-6、TNF、VEGFA、CXCL8、NOS3等靶点可以发挥抗炎作用，从而达到治疗肺炎的目的。研究表明PTGS2、PTGS1等靶点在炎症的治疗及RNA病毒的复制过程中发挥作用[37]。HSP90AA1免疫应答及抗炎作用较强[38]。目前IL-6被认为是COVID-19进展的预后生物标志物之一，可以指导新冠患者的病情进展、治疗及预后的评估等过程[39]。实验表明，IL-6作为炎症因子参与炎症的病理过程，VEGFA水平升高也可能与肺部炎症消退有关[40]，CXCL8也是具有趋化作用的炎性细胞因子。
其中CASP3、PPARG、GSK3B、MAPK14、VEGFA、AKT1、EGFR等靶点发挥调节人体免疫功能的作用。在病毒（包括冠状病毒）感染性疾病中病毒引发凋亡是十分常见的现象[41]。而CASP3、MAPK、B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）在细胞凋亡方面起关键作用[42-43]。AKT1主要参与调控细胞生长、异常增殖及葡萄糖代谢。IL-2、IL-6、TNF、VEGFA、EGFR等也是参与免疫的细胞因子，并参与合成、代谢等方面。
基于网络药理学研究，结合中医理论分析“柴胡-黄芩”药对治疗COVID-19的作用机制，在病毒感染后的肺炎治疗中，PTGS2、HSP90AA1、NOS2、IL-6、TNF、VEGFA、CXCL8、NOS3等多靶点直接发挥治疗肺炎的作用，CASP3、PPARG、GSK3B、MAPK14、VEGFA、AKTI、IL-2、IL-6、TNF等多靶点调节人体免疫功能以扶正祛邪。
“柴胡-黄芩”的靶标GO条目共1871个（P＜0.01），其中生物过程1752个，细胞组成24个，分子功能95个，分别占93.64%、1.28%、5.08%。生物过程条目占比最大，最具有代表性，主要为对脂多糖的反应、细菌源性分子的反应、细胞对生物刺激的反应等。细胞组成主要包括膜筏、膜微结构域等。分子功能主要为细胞因子受体结合、细胞因子活性、受体配体活性等。脂多糖可通过刺激免疫细胞和局部邻近细胞增加炎症因子的表达，进而诱导发生免疫反应。
KEGG结果显示主要通路为脂质与动脉粥样硬化、IL-17信号通路、糖尿病并发症晚期糖基化终末化产物（AGE）-晚期糖基化终末产物受体（RAGE）信号通路、流体切应力和动脉粥样硬化信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染、人类巨细胞病毒感染、Toll受体信号通路、coronavirus disease-COVID-19、Th17细胞分化等。
AGE-RAGE信号通路与糖尿病相关，通过大量促炎因子的释放造成炎症损伤。严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-Cov-2）可能通过与血管紧张素转换酶2（ACE2）的结合进入并破坏胰岛P细胞从而导致血糖升高，继而病情恶化，尤其是对于糖尿病的患者[44]。TNF可诱导多种细胞内信号通路，包括细胞凋亡、炎症、免疫等[45]，可引起促炎因子表达，从而参与全身炎症反应。研究表明COVID-19重症患者TNF-α水平比非重症患者高[46-47]。IL-17为能诱导多种细胞释放促炎因子，参与免疫调节。研究表明COVID-19患者的严重程度与IL-17等TH17细胞相关的促炎因子水平呈正相关[45]。因此，调控AGE-RAGE、TNF和IL-17信号通路可作为COVID-19的潜在治疗方法[44,48]。
“柴胡-黄芩”可能通过槲皮素、汉黄芩素、山柰酚、黄芩素、刺槐素等主要活性成分作用于VEGFA、TNF、IL6、TP53、AKT1等多靶点，参与氧化应激反应、对脂多糖的反应等多种生物学过程，激活或抑制激活或抑制糖尿病并发症AGE-RAGE、流体切应力和动脉粥样硬化等主要信号通路，抑制炎症、调节免疫，从而达到有效治疗COVID-19的目的。
本研究运用Excel、R语言、SPSS等软件对医圣张仲景的著作《伤寒论》中疫病相关方剂进行相关分析、关联规则与聚类分析，挖掘疫病用药组方规律，发现其药物使用以扶阳、顾护脾胃为主，获得5个类聚方，促进了张仲景治疗疾病经验的挖掘、传承及古方今用，也可为COVID-19预防与治疗、新方发现与新药研发提供参考。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第九版）》指出COVID-19是疫戾之气所犯，属于中医角度“疫病”范畴[5]，COVID-19是因为感受疫戾之气，在辨证论治上，对轻型和普通型患者按寒湿、湿热、湿毒辨证，重型则强调按疫毒论治。
国家中医药管理局推荐抗击COVID-19疫情的典型代表“三药三方”为金花清感颗粒、连花清瘟颗粒/胶囊、血必净注射液及清肺排毒汤、化湿败毒方、宣肺败毒方。清肺排毒汤由《伤寒论》中的小柴胡汤与麻杏石甘汤、五苓散等经典方剂优化配伍而成，是治疗COVID-19的“三药三方”之一，这反映了中医防治疫病不为病毒所影响，可以根据病因病机灵活组方遣药，体现了古方今用的新价值优势。
本研究相关分析、关联规则、聚类分析结果中，均显示出这些方剂当中的主要配伍成分，其中聚类方中的小柴胡汤、麻杏石甘汤为清肺排毒汤配伍的主要方剂，麻杏石甘汤以及相关分析和关联规则结果中排名靠前的“甘草、麻黄→苦杏仁”“麻黄-苦杏仁”等药对为化湿败毒方中主要配伍成分。但数据挖掘需要理论与实践相结合，缺乏结合后世使用经方经验，故本研究挖掘出的用药规律还需进一步临床验证。最后，对挖掘出具有代表性的核心药对“柴胡-黄芩”进行了网络药理学分析，阐释了“柴胡-黄芩”治疗COVID-19可能的作用机制，为后续研究提供了一定的理论基础。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：汤少梁，贡 悦，冯雨莉，杨彤玲，张 蒙，申俊龙，成 彦．《伤寒论》治疫方用药规律分析及核心药对治疗COVID-19的作用机制研究 [J]. 中草药, 2023, 54(1):192-209.
联系客服
