首席医学网 2010年08月17日 22:40:54 Tuesday
全国20个主要产地茯苓质量分析比较研究
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作者：昝俊峰1,徐 斌1,於小波1,苏 玮2,王克勤2,刘焱文1 作者单位：(1.湖北中医学院中药资源与中药复方省部共建教育部重点实验室,湖北 武汉 430061;2.湖北省中医药研究院,湖北 武汉 430073)
【摘要】 目的 建立茯苓多糖和茯苓酸的含量测定方法,分析比较全国20个主要产地茯苓中茯苓多糖和茯苓酸的含量,为评价不同产地茯苓的质量品质提供依据。方法 采用分光光度法测定茯苓多糖的含量,碱提,苯酚-浓硫酸显色,葡萄糖为对照品,检测波长490 nm。采用RP-HPLC法测定茯苓酸的含量,Kromasil 100-5C18色谱柱,柱温30 ℃,流动相为乙腈-0.2%甲酸(80∶20),流速1.0 mL/min,检测波长242 nm。结果 葡萄糖在40～200 ?g/mL范围内线性良好,r=0.999 9,平均回收率为99.72%,RSD=0.99%;茯苓酸在0.48～2.40 ?g范围内与其色谱峰面积呈良好线性关系,r=0.999 7,平均回收率100.26%,RSD=1.26%。不同产地茯苓药材中茯苓多糖和茯苓酸的含量有较大差异,说明药材质量并不一致。结论 该方法简便快速、准确可靠,为评价不同产地茯苓药材的质量提供了一种可靠的分析方法。
【关键词】 茯苓;茯苓多糖;茯苓酸;分光光度法;高效液相色谱法
Comparative Study on the Quality of Poria Cocos from 20 Different Origin Places ZAN Jun-feng, XU Bin, YU Xiao-bo, et al (Provincial and Ministry of Education Key Laboratory of Resource Science and Chinese Herbal Compound, Hubei College of TCM, Wuhan 430061, China)
Abstract：Objective To establish a method for determining the content of effective ingredient pachymaran and Pachymic acid in Poria, compare the content of pachymaran and Pachymic acid of Poria cocos from different origin places, and provide an evidence to evaluate the quality of Poria cocos. Methods Spectrophotometry method was used for determination of pachymaran, with phenol-sulfuric acid color, glucose as the standard and the detection wave length at 490 nm. RP-HPLC method was used for determination of Pachymic acid in Poria. The chromatographic conditions were Kromasil 100-5C18 column, acetonitrile-0.2% methanoic acid (80∶20) as mobile phase, flow rate being 1.0 mL/min, column temperature at 30 ℃, and detection wavelength at 242 nm. Results Glucose (40～200 ?g, r=0.999 9) and Pachymic acid (0.48～2.40 ?g, r=0.999 7) showed a fine linear. The average recovery rate of Pachymic acid was 100.26% with RSD=1.26%. There was a difference in the content of pachymaran and Pachymic acid of Poria cocos from different origin places, suggesting that the quality of Poria cocos was different. Conclusion The method is easy, speed, accarute and reliable. It provides an analysis method to evaluate the quality of Poria cocos from different origin place.
Key words：Poria;pachymaran;Pachymic acid;spectrophotometry;HPLC
茯苓是多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核,具有渗湿利尿、和胃健脾、宁心安神的功效;主要用于治疗小便不利、水肿、脾胃气虚、食少便溏、体倦乏力及心神不宁、惊悸、失眠等症。药理研究表明,茯苓具有抗肿瘤、调节免疫功能、抗炎、抗过敏等生物活性[1]。我国茯苓资源分布广泛,主要来源于湖北、安徽、云南、四川、广西、福建、贵州等省区,浙江、陕西、河南、广东等省区亦有栽培。由于各地的生态环境存在差异,所产茯苓药材的品质良莠不齐。为了有效控制茯苓药材的质量,本试验分别采用紫外-可见分光光度法、反相高效液相色谱法对全国不同产地茯苓中茯苓多糖和茯苓酸的含量进行了综合比较研究,为评价茯苓药材的质量提供了理论依据。
1 仪器与试药
SHIMADZU UV-2041PC紫外-可见分光光度计、电子控温水浴锅。Agilent1100 液相色谱仪,紫外检测器,Agilent色谱工作站;KQ3200DE型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司);sartonus型电子天平(十万分之一,德国)。茯苓酸对照品为本实验室自制,其纯度大于98%;茯苓药材分别采自湖南、河南、四川、浙江、贵州、安徽、湖北、广州、福建、云南、广西等20个产地,经湖北省中医药研究院王克勤教授鉴定为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos (Schw.) Wolf。浓硫酸、苯酚(分析纯)、葡萄糖标准品(购于中国生物药品制品检定所)。乙腈为色谱纯,水为重蒸馏水,其他试剂均为分析纯。
2 茯苓多糖的含量测定
2.1 供试品溶液的制备
取新鲜茯苓菌核,去表皮得白色菌核,菌核切块,干燥,粉碎,过60目筛得茯苓粉末。精密称取不同产地茯苓粉末1.000 0 g,加25 mL石油醚于70 ℃水浴中回流2 h,冷却,过滤,滤渣干燥后加0.1 mol/L NaOH溶液100 mL,搅拌1 h(<5 ℃),混合溶液以3 500 r/min离心15 min,取上清液。上清液用10%冰乙酸溶液调pH值5～6,使其成糊状,将糊状物离心处理,弃上清液,残留物置透析袋中用蒸馏水洗涤12 h,以同样方法离心,得白色胶状沉淀,即为茯苓多糖。将茯苓多糖置于200 mL量瓶中加水溶解至刻度,缓慢搅拌均匀,吸取0.5 mL置于10 mL容量瓶中,用水稀释至刻度,即得茯苓多糖供试品溶液。
2.2 对照品溶液的制备
精取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖0.025 g,置于25 mL棕色容量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,取1.00 mL置5 mL棕色容量瓶中,加水稀释制成0.2 mg/mL的溶液,作为贮备液,备用。
2.3 标准曲线及线性范围
分别精密吸取葡萄糖对照品溶液40、80、120、160、200 ?g/mL溶液各2.0 mL置20 mL试管中,分别加入5%苯酚溶液1.75 mL,充分混合后,再分别缓慢加入6.00 mL浓硫酸溶液,迅速摇匀,室温下放置40 min,在分光光度仪上于490 nm处测定样品溶液的吸收值,以浓度(C)对吸收值(A)进行线性回归,计算,得回归方程：A=0.004 4C+0.025 6(r=0.999 9),葡萄糖在40～200 ?g/mL范围内线性良好。
2.4 精密度试验
精密吸取对照品溶液1.0 mL,按选择条件测定吸收值5次,吸收值依次为0.439、0.437、0.437、0.438、0.438,RSD=0.19%(n=5),表明仪器精密度良好。
2.5 稳定性试验
精密吸取1.0 mL供试品溶液,于0、1、2、4、8、24 h按选择条件测定吸收值,吸收值依次为0.437、0.438、0.439、0.439、0.439、0.441,RSD=0.31%(n=6),表明供试品溶液在24 h内检测稳定。
2.6 重复性试验
精密量取供试品溶液1.0 mL,共5份,按选择条件测定吸收值,吸收值依次为0.436、0.445、0.436、0.427、0.443,RSD=1.48%(n=5),表明本方法重复性好。
2.7 加样回收率试验
精密称取已知含量的供试品溶液6份,每份0.25 g,分别准确加入一定量的葡萄糖对照品,按“2.1”项下方法制成供试品溶液,精密量取各供试品溶液0.5 mL,按选择条件测定吸收值,计算回收率。平均回收率为99.72%,RSD=0.99%,表明方法稳定可行。结果见表1。表1 加样回收率试验结果(n=6)
2.8 样品测定
取茯苓多糖供试品溶液2.0 mL置20 mL试管中,分别加入5%苯酚溶液1.75 mL,充分混合后,再分别缓慢加入6.0 mL浓硫酸溶液,迅速摇匀,室温下放置40 min,在分光光度仪上测定样品溶液的吸收值(检测波长490 nm),共测定20个产地的茯苓药材,测定结果见表2。表2 不同产地茯苓中茯苓多糖含量测定结果
3 茯苓酸的含量测定
3.1 色谱条件
色谱柱：Kromasil 100-5C18(250 mm×4.6 mm,5 ?m);柱温30 ℃;流动相：乙腈-0.2%甲酸水溶液(80∶20);流速：1.0 mL/min;检测波长：242 nm。色谱图见图1。
图1 茯苓HPLC图谱
3.2 对照品溶液的制备
精密称取茯苓酸对照品2.40 mg,置于10 mL容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得(浓度为0.240 mg/mL)。
3.3 供试品溶液的制备
精密称取茯苓粉末(过60目筛)约(0.500 0±0.000 5)g, 置于50 mL具塞锥形瓶中,准确加甲醇25 mL,称定,浸泡25 min,超声90 min,放置,称重,用甲醇补足减失的重量,滤过,弃初滤液;准确吸取续滤液5 mL,置于蒸发皿中,水浴蒸干,残留物用甲醇定容至2 mL容量瓶中,即得。
3.4 线性关系的考察
精密吸取浓度分别为0.096、0.144、0.196、0.240 mg/mL茯苓酸对照品溶液10 ?L,注入高效液相色谱仪中,测定其峰面积积分值。以对照品进样量为横坐标,峰面积积分值为纵坐标,绘制标准曲线并进行线性回归,得回归方程：Y=202.99X-17.185(r=0.999 7),结果表明茯苓酸在0.48～2.40 ?g范围内呈良好线性关系。
3.5 精密度试验
精密吸取同一样品溶液10 ?L,重复进样6次,茯苓酸的峰面积依次为472.2、477.3、483.9、480.2、475.6、466.9,平均值为475.78,RSD=0.50%(n=6),结果表明仪器精密度良好。
3.6 稳定性试验
精密吸取同一样品溶液,分别于0、1、2、4、8、24 h各进样10 ?L,测得茯苓酸的峰面积值依次为272.0、278.2、273.9、280.2、275.6、276.9,平均值为276.93,RSD=1.07%(n=6),结果表明供试品溶液在24 h内稳定。
3.7 重复性试验
精密称定同一批茯苓粉末0.5 g,共6份,按“2.3”项下方法操作,各精密吸取10 ?L进样,测定茯苓酸的含量依次为1.461 1、1.427 1、1.466 0、1.458 6、1.424 2、1.506 4,RSD=2.06%,结果表明该方法重复性好。
3.8 加样回收率试验
精密称取已知含量的样品0.25 g,共9份,分别加入一定量的茯苓酸对照品,按“3.3”项下方法制备并测定含量,计算RSD=1.26%(n=9),表明该方法稳定可行,结果见表3。表3 加样回收率试验结果(n=9)
3.9 样品测定
取不同产地茯苓粗粉,按“3.3”项下方法制备供试品溶液, 用0.45 ?m微孔滤膜过滤,滤液密封备用,分别精密吸取各供试品溶液10 ?L,注入液相色谱仪,按上述色谱条件测定,计算样品溶液中茯苓酸的含量。结果见表4。表4 不同产地茯苓中茯苓酸含量测定结果
4 讨论
本试验对20个不同产地茯苓药材的茯苓多糖和茯苓酸进行了含量分析比较研究,测定数据可靠性强。这种综合评价方法能较全面地反映茯苓药材的质量。
茯苓药材是菌种依附松木繁殖的菌类中药材,其生态环境、不同菌种和培育技术对其质量均具有较大的影响。本研究结果为探讨茯苓药材的资源品质与其生态环境的相关性提供了参考依据。
湖北罗田县所产的茯苓为地道药材,拥有500多年的栽培经验,出口日本、欧洲和东南亚等国,其药材品质驰名国内外,被国家科技部批准为种植基地。本研究结果表明,湖北罗田县及邻近县市所产茯苓药材的茯苓多糖和茯苓酸均高于其他省市产地,从而为湖北产地道茯苓药材优良品质提供了科学依据。
【参考文献】
[1] 赵吉福,何爱民,陈英杰.茯苓抗肿瘤成分研究[J].中国药物化学杂志, 1993,3(2)：128-129.
