摘要：本项目研究了沙棘籽原花青素提取物对小鼠体内免疫调节作用。根据沙棘籽原花青素提取物软胶囊人体推荐日摄入量0.0433g/kg BW扩大10、20、30倍设置低、中、高三个剂量组，即0.433、0.867、1.300g/kg BW，另设阴性对照组和溶剂对照组。采用SPF级昆明种小鼠，连续经口灌胃给予，30天后开始实验。实验结果以P
现代药理研究表明，原花青素具有抗氧化、抗突变、抗肿瘤、抗癌、抗炎、抗过敏、抗病毒、保护心血管、保护肝肾功能、调节机体免疫力等生物药理活性，此外还有改善视力、营养皮肤和美容、促进毛发生长等作用[1~5]。国内外对原花青素的提取及活性研究多集中在葡萄、苹果、莲房等原料。从沙棘中提取原花青素的研究报道很少。
沙棘富含近200种营养及生物活性成分，原花青素是其中主要有效成分之一[6]。但国内目前对沙棘开发与利用的研究多是关于沙棘中维生素、脂肪酸、黄铜等营养活性成分，对沙棘中原花青素的活性研究很少，对沙棘籽原花青素提取物研制成保健食品尚属空白。本项目通过研究沙棘籽原花青素提取物对小鼠ConA诱导的脾淋巴细胞转化试验、DNFB诱导迟发型变态反应、血清溶血素的测定、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验、小鼠碳廓清试验、脏器体重比的影响，旨在研究沙棘籽原花青素提取物对小鼠免疫调节作用，将其研制成增强免疫力软胶囊保健食品，其结果报告如下：
1 材料与方法
1.1 样品来源及处理
高原圣果牌沙棘花青素软胶囊，内容物为棕色油乳状液体，来源于高原圣果沙棘制品有限公司，人体推荐日摄入量为0.0433g/kg BW。
样品配制：准确称取受试物2.165 g、4.335 g、6.500g,分别用大豆油（溶剂）定容至100mL，作低、中、高剂量组小鼠灌胃用供以下试验用。
1.2 实验动物及环境
SPF级昆明种雌性小鼠，18-22g，由湖北省实验动物研究中心提供。实验动物生产许可证号：SCXK(鄂)2003-0005；实验动物使用许可证号：SYXK(鄂)2003-0014。动物饲养室温度为20-25℃，湿度为40-70%。
1.3 剂量分组
按人体推荐日摄入量0.0433/kgBW扩大10、20、30倍设置低、中、高三个剂量组，即0.433、0.876、1.300g/kgBW，共分四个实验组, 每实验组包括阴性对照组和溶剂对照组、低、中、高剂量组，各剂量组实验动物数为10只。免疫实验一组进行迟发型变态反应和小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验；免疫实验二组进行淋巴器官/体重比值测定和碳廓清实验；免疫实验三组进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验；免疫实验四组进行血清溶血素的测定和抗体生成细胞检测。小鼠连续灌胃30天后开始试验。各实验组均按0.20ml/10g BW容量经口灌胃给予，阴性对照组给予蒸馏水，溶剂对照组给予大豆油。
1.4 试验方法
1.4.1 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验
方法：无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200 目筛网过滤，用Hank’s液洗2次，每次离心10min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于1mL的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数（应在95％以上），调整细胞浓度为3 ×106个／mL。将每一份脾细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔 1mL，一孔加 75μL ConA液（相当于 7.5 μg／mL），另一孔作为对照，置 5％CO2，37 ℃ CO2孵箱中培养 72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不合小牛血清的RPMIl640培养液，同时加入MTT（5mg／mL）50μL ／孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入 1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔作3个平行孔，（100μL/孔）用酶标仪以570nm波长测定光密度值。
1.4.2 二硝基氟苯(DNFB)诱导迟发型变态反应(DTH)
方法：耳肿胀法。用1%DNFB(以1:1 的丙酮麻油溶液配制)致敏小鼠后，第5天再用DNFB攻击右耳，24h后处死动物剪下左右耳壳用打孔器取下直经8mm的耳片，称重，以左右耳的重量之差来表示DTH的程度。
1.4.3 血清溶血素的测定
方法：血凝法。取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心（2000r/min）10min。将压积SRBC用生理盐水配成2％（v／v）的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。4～5天
后，摘除眼球取血于离心管内，放置约l h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。
凝集反应：用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内，每孔 100μL，再加入 100μL 0.5％（v/v） SRBC悬液，混匀，装入湿润的平盘内并加盖，于37oC温箱孵育3h，观察血球凝集程度。根据血清凝聚程度的级别计算出抗体积数。
1.4.4 腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验
方法：半体内法。制备20％的鸡红细胞悬液；每只鼠腹腔注射1mL该悬液，30min后处死动物，将其仰位固定于鼠板上，开腹，经腹腔注入生理盐水2mL，转动鼠板1min，然后，吸出腹腔洗液1mL，平均分滴于2片载玻片上，37℃温育30min；育毕用生理盐水漂洗，晾干，以1:1 的丙酮甲醇溶液固定，4％Giemsa-磷酸缓冲液染色3min，再用蒸馏水漂洗晾干。油镜下计数100个巨噬细胞，按下式计算吞噬率和吞噬指数：
吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数 被吞噬的鸡红细胞总数
吞噬率(％)= ──────────── ×100 吞噬指数= ─────────
计数的巨噬细胞数 计数的巨噬细胞数
1.4.5 小鼠碳廓清试验
方法：按体重从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁（10mL/kg），待墨汁注入，立即计时。注入墨汁后2、10min，分别从内眦静脉丛取血20μL，并立即将其加到2mL0.1% Na2CO3溶液中。各吸0.1mL于96孔酶标板中，用酶标仪在600nm波长处测光密度值（OD），以Na2CO3溶液作阴性对照。
将小鼠处死。取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，分别称重。
以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。按下式计算吞噬指数a。受试样品组的吞噬指数显著高于对照组，可判定该项实验结果阳性。
LgOD1—lgOD2
K＝———―――—
t2—t1
体重
吞噬指数a＝———―――× Κ1/3
肝重十脾重
1.4.6 抗体生成细胞检测
取脱纤维的羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心（2000r／min）10min，每只鼠经腹腔注射2%(v/v)SRBC 0.2mL。
将SRBC免疫4～5天后的小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，放在盛有Hank’s液的小平皿内，轻轻磨碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，离心（1000/min）10min，用Hank’s液洗2遍，最后将细胞悬浮在5mL RPMI1640培养液中，计数细胞，并将细胞浓度调整为5×106个／mL。
空斑的测定：将表层培养基(1g琼脂糖加双蒸水至100mL)加热溶解后，放45～50℃水
浴保温，与等量pH7.2～7.4、2倍浓度的 Hank’s液混合，分装小试管，每管 0.5mL，再向管内加 50μL 10％SRBC（v／v，用SA缓冲液配制），20μL脾细胞悬液（5×106个／mL），迅速混匀，倾倒于己刷琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中孵育1.5h，然后用SA缓冲液稀释的补体(1:8)加人玻片架凹槽内，继续温育1.5h后，计数溶血空斑数。
2 结果
2.1 高原圣果牌沙棘花青素软胶囊对小鼠体重的影响：见表1、表2、表3、表4，各实验组小鼠试验前后体重与溶剂对照组、阴性对照组比较，差异无显著性，表明高原圣果牌沙棘花青素软胶囊对小鼠体重无明显影响。
表1 实验一组试验前后动物体重记录( ±S)
组别
剂量
(g/kg BW)
动物数(只)
体重(克)
增重(克)
试验前
试验后
阴性对照组
0.0
10
19.2±0.8
33.3±1.4
14.1±1.4
溶剂对照组
0.0
10
19.2±0.8
33.3±1.1
14.2±1.0
低剂量组
0.433
10
19.3±0.9
33.2±1.6
13.9±1.4
中剂量组
0.867
10
19.4±1.0
33.2±1.3
13.8±1.2
高剂量组
1.300
10
19.8±0.8
33.4±0.8
13.6±0.9
表2 实验二组试验前后动物体重记录( ±S)
组别
剂量
(g/kg BW)
动物数(只)
体重(克)
增重(克)
试验前
试验后
阴性对照组
0.0
10
19.4±0.9
33.6±1.3
14.2±1.4
溶剂对照组
0.0
10
19.1±0.8
32.7±1.1
13.6±0.9
低剂量组
0.433
10
18.6±0.4
32.6±1.2
13.9±1.1
中剂量组
0.867
10
19.1±1.2
32.7±1.6
13.6±1.7
高剂量组
1.300
10
18.9±0.9
32.7±1.1
13.7±1.2
表3 实验三组试验前后动物体重记录( ±S)
组别
剂量
(g/kg BW)
动物数(只)
体重(克)
增重(克)
试验前
试验后
阴性对照组
0.0
10
19.3±1.0
33.4±1.9
14.1±1.6
溶剂对照组
0.0
10
19.3±0.6
33.0±1.2
13.7±0.9
低剂量组
0.433
10
19.3±0.9
32.9±1.6
13.6±1.1
中剂量组
0.867
10
19.1±0.7
32.5±1.1
13.5±1.2
高剂量组
1.300
10
19.2±0.6
32.5±1.0
13.3±1.2
表4 实验四组试验前后动物体重记录( ±S)
组别
剂量
(g/kg BW)
动物数(只)
体重(克)
增重(克)
试验前
试验后
阴性对照组
0.0
10
19.0±0.9
33.0±0.9
14.0±1.2
溶剂对照组
0.0
10
19.2±0.8
33.1±2.1
13.9±1.6
低剂量组
0.433
10
19.2±0.8
32.6±1.8
13.4±1.5
中剂量组
0.867
10
19.4±0.8
33.1±1.1
13.7±1.2
高剂量组
1.300
10
19.4±0.8
33.2±1.2
13.8±1.0
2.2 高原圣果牌沙棘花青素软胶囊对动物淋巴器官/体重比值的影响：见表5。各组动物间胸腺/体重比值和脾脏/体重比值与溶剂对照组、阴性对照组比较，差异均无显著性（p>0.05）。
表5 对动物淋巴器官/体重比值的影响( ±S)
组别
剂量
(g/kg BW)
动物数
(只)
胸腺/体重比值(×10-3)
p值
脾脏/体重比值(×10-3)
p值
溶剂
阴性
溶剂
阴性
阴性对照组
0.0
10
2.71±0.22
0.962
-
3.69±0.25
0.724
-
溶剂对照组
0.0
10
2.72±0.30
-
0.962
3.73±0.25
-
0.724
低剂量组
0.433
10
2.67±0.21
0.681
0.662
3.74±0.33
0.894
0.665
中剂量组
0.867
10
2.69±0.26
0.828
0.840
3.67±0.32
0.665
0.898
高剂量组
1.300
10
2.72±0.32
0.988
0.949
3.70±0.32
0.828
0.929
注：（溶剂）表示对溶剂对照组比较，（阴性）表示对阴性对照组比较
2.3 高原圣果牌沙棘花青素软胶囊脾淋巴细胞转化实验结果：见表6。从表6可见，与溶剂对照组、阴性对照组比较，高剂量组显著性增强ConA诱导的脾淋巴细胞增殖能力(P 高原圣果牌沙棘花青素软胶囊对小鼠细胞免疫功能影响( ±S)
组别
剂量
(g/kg BW)
动物数
(只)
ConA诱导脾淋巴细胞增殖OD差值
p值
DNFB诱导DTH左右耳重量差(mg)
p值
溶剂
阴性
溶剂
阴性
阴性对照组
0.0
10
0.064±0.016
0.999
-
9.38±2.74
1.000
-
溶剂对照组
0.0
10
0.062±0.030
-
0.999
9.15±3.38
-
1.000
低剂量组
0.433
10
0.072±0.037
0.826
0.917
11.11±3.81
0.465
0.572
中剂量组
0.867
10
0.081±0.024
0.371
0.482
12.34±3.12
0.101
0.141
高剂量组
1.300
10
0.103±0.027
0.014
0.022
13.52±2.94
0.014
0.021
注：（溶剂）表示对溶剂对照组比较，（阴性）表示对阴性对照组比较
2.4 高原圣果牌沙棘花青素软胶囊对小鼠迟发型变态反应的影响：见表6。从表6可见：与溶剂对照组、阴性对照组比较，高原圣果牌沙棘花青素软胶囊高剂量组显著性增强小鼠对DNFB诱发的DTH反应(P
组别
剂量
(g/kg BW)
动物数(只)
血清溶血素
(抗体积数)
P值
溶剂
阴性
阴性对照组
0.0
10
56.4±14.3
0.997
-
溶剂对照组
0.0
10
55.0±11.1
-
0.997
低剂量组
0.433
10
61.5±13.5
0.579
0.756
中剂量组
0.867
10
64.1±10.0
0.290
0.433
高剂量组
1.300
10
71.3±11.6
0.016
0.031
注：（溶剂）表示对溶剂对照组比较，（阴性）表示对阴性对照组比较
2.6 高原圣果牌沙棘花青素软胶囊对腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞功能的影响：见表8。从表8可见，与溶剂对照组、阴性对照组比较，高原圣果牌沙棘花青素软胶囊高剂量组明显提高吞噬率和吞噬指数 (P 高原圣果牌沙棘花青素软胶囊对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响( ±S)
剂量
(g/kg. BW)
动物数
(只)
吞噬百分率
（%）
p值
吞噬指数
p值
溶剂
阴性
溶剂
阴性
阴性对照组
0.0
10
22.40±2.27
1.000
-
0.321±0.034
0.989
-
溶剂对照组
0.0
10
22.20±2.30
-
1.000
0.315±0.022
-
0.989
低剂量组
0.433
10
23.90±3.07
0.517
0.601
0.335±0.029
0.567
0.813
中剂量组
0.867
10
25.10±3.87
0.135
0.172
0.340±0.049
0.373
0.609
高剂量组
1.300
10
26.00±3.20
0.030
0.040
0.367±0.044
0.011
0.027
注：（溶剂）表示对溶剂对照组比较，（阴性）表示对阴性对照组比较
2.7 高原圣果牌沙棘花青素软胶囊对碳廓清功能的影响：见表9。从表9可见，与溶剂对照组、阴性对照组比较，高原圣果牌沙棘花青素软胶囊高剂量组显著性提高小鼠碳廓清吞噬指数(P
表9 高原圣果牌沙棘花青素软胶囊对小鼠碳廓清功能的影响( ±S)
组别
剂量
(g/kg BW)
动物数(只)
吞噬指数a
P值
溶剂
阴性
阴性对照组
0.0
10
5.39±0.51
1.000
-
溶剂对照组
0.0
10
5.36±0.77
-
1.000
低剂量组
0.433
10
5.85±0.70
0.227
0.268
中剂量组
0.867
10
5.97±0.43
0.094
0.116
高剂量组
1.300
10
6.13±0.58
0.024
0.031
注：（溶剂）表示对溶剂对照组比较，（阴性）表示对阴性对照组比较
2.8高原圣果牌沙棘花青素软胶囊对抗体生成细胞功能的影响：见表10。从表10见，与溶剂对照组、阴性对照组比较，高原圣果牌沙棘花青素软胶囊高剂量组能明显增强抗体生成细胞能力(P
表10 高原圣果牌沙棘花青素软胶囊对抗体生成细胞功能的影响( ±S)
组别
剂量
(g/kg BW)
动物数
(只)
溶血空斑数
(/106脾细胞)
p值
溶剂
阴性
阴性对照组
0.0
10
177.0±20.58
0.961
-
溶剂对照组
0.0
10
171.0±24.70
-
0.961
低剂量组
0.433
10
197.0±24.97
0.102
0.273
中剂量组
0.867
10
200.0±33.67
0.058
0.171
高剂量组
1.300
10
208.0±25.73
0.010
0.039
注：（溶剂）表示对溶剂对照组比较，（阴性）表示对阴性对照组比较
3 结论
3.1 沙棘籽原花青素提取物能明显增强ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖能力；
3.2 沙棘籽原花青素提取物能明显增强二硝基氟苯诱导的小鼠迟发型变态反应；
3.3 沙棘籽原花青素提取物能明显升高小鼠血清溶血素含量；
3.4 沙棘籽原花青素提取物能明显增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞功能；
3.5 沙棘籽原花青素提取物能明显增强小鼠碳廓清能力；
3.6 沙棘籽原花青素提取物能明显增强抗体生成细胞能力；
3.7 沙棘籽原花青素提取物在提高小鼠免疫力的同时没有负面影响。
参考文献
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