白花蛇舌草为茜草科植物白花蛇舌草的全草，临床上广泛肠癌等消化系统肿瘤以及子宫颈癌、淋巴癌、鼻咽癌等。半枝莲为唇形科黄芩属植物半枝莲的全草，临床多用于治疗肝癌、肺癌、胃癌、直肠癌和鼻咽癌。鉴于白花蛇舌草有清热解毒兼消肿止痛的作用，半枝莲具有清热解毒又有活血化瘀作用，因此两药配伍，将有似中药七情配伍中的相须之用，可增强抑癌、排毒作用。多糖是半枝莲和白花蛇舌草的重要活性成分之一，多糖具有增强免疫力、抗肿瘤、降血糖、抗氧化和抗衰老等功能。因此笔者旨在探讨半枝莲和白花蛇舌草(质量比为1﹕1)总多糖对S180 荷瘤小鼠的抗肿瘤作用及其对免疫功能的影响，为进行创新药物的研究和开发奠定基础。
1 材料
1.1 受试药物 半枝莲和白花蛇舌草(质量比1﹕1)总多糖：将半枝莲和白花蛇舌草用石油醚浸泡脱脂后水煎，离心取上清液，减压浓缩干燥，得水提取物，即粗品，粗品经氯仿；正丁醇脱蛋白，得脱蛋白多糖即粗品多糖，再经DEAD-纤维柱层析，得精品多糖(白花蛇舌草购自重庆中药材饮片厂有限公司，产地江西，批号100401；半枝莲购自太极集团四川绵阳制药有限公司，产地湖北，批号55100005)；注射用环磷酰胺：江苏恒瑞医药有限公司生产，批号：09071823。
1.2 实验动物 昆明小鼠，SPF级动物，由重庆医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK(渝)2007-0001。
1.3 实验仪器和试剂 电子天平：北京赛多利斯有限公司；SW-CJ-1F型超净工作台：苏净集团安泰公司；电热恒温水浴锅：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；Allegra X-12离心机：美国贝克曼库尔特有限公司；手提式消毒器：山东安得医疗科技有限公司；722分光光度仪：重庆川仪九厂；流式细胞仪：COULTER EPICS Elite。酶标仪：ThermoLabsys-tems公司；二氧化碳培养箱：美国Forma公司；小牛血清：四季青生物工程材料有限公司；印度墨水 MTT DM-SO和RPMI-1640培养基：Sigma公司；小鼠肉瘤180(S180)瘤株：重庆医科大学基础医学院惠赠传代。
2 方法
2.1 对S180 细胞生长的影响 分别取对数生长期的S180 瘤细胞，用胰蛋白酶消化后，用含10%小牛血清的培养液配成浓度为1X10^4个/mL的细胞悬液，接种在96孔培养板中，每孔190µL，置含5%CO2 的37℃细胞培养箱中，培养24h后，待贴壁细胞贴壁完全后，每孔加入不同的药物10µL，按实验设计分别加入5个不同浓度的总多糖(25、50、100、200、400µg/mL)与阳性对照药环磷酰胺10µL，另设不加药的空白对照组。于培养箱中培养48h后，随后每孔加入10 µL的MTT(1mg/mL)溶液，振荡混匀后37℃继续培养4h，弃去上清液，加入200µL DMSO溶解，平板振荡仪振荡10min，在酶标仪上用波长492nm，参比波长为570nm的条件下测定各孔吸光度(OD)值，计算抑制率[抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值) X100%]。
2.2 对S180 细胞周期的影响 取对数生长期小鼠S180 瘤细胞株，调整浓度为3X10^5mL·20mL，接种于100mL细胞培养瓶中，加入总多糖，使其终浓度分别为25µg/mL、50µg/mL、100µg/mL 、200µg/mL 、400µg/mL，37℃、饱和湿度、5%CO2培养48h后收获细胞，PBS洗涤2次，70%冷乙醇固定，RNase消化，碘化丙啶(PI)室温染色30min后，流式细胞仪激发光波长为488nm，检测细胞数为10000。结果用COUL-TERElite流式分析软件计算各期细胞百分数。
2.3 对S180 移植性实体瘤生长的影响 取小鼠60只，无菌条件下，取接种7天的S180瘤细胞，按比例稀释计数、调整瘤细胞数为107个/mL，0.2mL接种于每只小鼠右腋皮下，次日称重后随机分为5组，荷瘤对照组20只，其余每组10只，按 表3 灌胃给药，每天1次，连续10天(其中环磷酰胺组皮下给药) 末次给药后24h，脱颈椎处死动物、称体重，剥离肿瘤、胸腺、脾脏，称质量，计算抑瘤率、胸腺与脾脏指数。计算公式如下：抑瘤率(%)=[(对照组平均瘤重-药物组平均瘤重)/对照组平均瘤重] X100%；胸腺(脾脏)指数=胸腺(脾脏)质量(mg)/体质量(g)。
2.4 对S180 荷瘤小鼠体液免疫功能的影响 取昆明种小鼠60只，无菌条件下，取接种7天的S180 瘤细胞，按比例稀释计数、调整瘤细胞数为10^7个/mL，0.2mL/只(即每只小鼠接种瘤细胞数约为2X10^6个)接种于小鼠右腋皮下，次日称重后随机分为6组，按 表5 灌胃给药，每天1次，连续10天。其中环磷酰胺组皮下给药，于初次免疫后24h隔天给药1次，共给药3次，正常对照组和荷瘤对照组则给予相应体积蒸馏水于给药第4天每只动物腹腔注射4%鸡红血球生理盐水0.2mL进行初次免疫，末次给药后1h眼眶取血20µL于生理盐水试管中，每管加入5%鸡红血球生理盐水0.5mL及10%豚鼠血清0.5mL。混匀后放入37℃水浴中30min，取出后置冰浴中终止反应。2000rpm离心10min，每管取1mL上清液加入血红蛋白稀释液3mL，放置10min。于540nm波长处比色测光密度(OD)值，计算半数溶血素HC50 值。
2.5 对S180 荷瘤小鼠网状内皮系统吞噬功能的影响 取昆明种小鼠60只，无菌条件下，取接种7天的S180 瘤细胞，按比例稀释计数、调整瘤细胞数为10^7个/mL，0.2mL/只(即每只小鼠接种瘤细胞数约为2X10^6个)接种于小鼠右腋皮下，次日称重后随机分为6组，每组10只，按 表6 灌胃给药(其中环磷酰胺组皮下给药)，每天1次，连续10天末次给药后24h，尾静脉注射印度墨汁0.1mL/10g体重，注射完毕立即计时，与30s(T1)及10min(T2)从小鼠眼眶后静脉丛取血20µL，立即放入0.1%碳酸钠溶液2mL中，并充分洗净采血管壁附着的血液，在分光光度仪680nm处，以20µL正常小鼠血溶于0.1%碳酸钠溶液2mL中校零点，读取并记录各测定管OD值。处死动物，称体重(W)，剖取肝脾，称其合重(WLS)。按下式计算吞噬指数K及吞噬系数α值。
吞噬指数
吞噬系数
2.6 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件计算，实验各组所得数据均以(` x±s）表示，多组间差异性比较采用方差分析(one-wayANOVA)。
3 结果
3.1 半枝莲和白花蛇舌草总多糖体外对S180 瘤细胞株的抑制作用 见表1。浓度为25 µg/mL 、50 µg/mL 、100µg/mL、200 µ g/mL和400 µg/mL的半枝莲和白花蛇舌草总多糖均可抑制S180 瘤细胞株的增殖，抑制率分别为17.09% 、21.61%、29.35% 、35.74%和40.56%，且抑制作用呈浓度-效应依赖性。提示半枝莲和白花蛇舌草总多糖有一定直接杀伤体外培养S180 瘤细胞株的作用。
3.2 半枝莲和白花蛇舌草总多糖体外对S180 瘤细胞株的细胞周期影响 见表2。浓度为100µg/mL、200µg/mL和400µg/mL的半枝莲和白花蛇舌草总多糖均使G0/G1 期细胞百分数增加，而环磷酰胺使G0/G1期细胞百分数降低，与半枝莲和白花蛇舌草总多糖的作用相反；总多糖各浓度对S期细胞的百分数没有明显影响，而环磷酰胺使S期细胞的百分数减少；浓度为50µg/mL、100µg/mL、200µg/mL和400µg/mL的半枝莲和白花蛇舌草总多糖均使G2/M期细胞百分数下降，而环磷酰胺作用相反使G2/M期细胞百分数增加。
3.3 半枝莲和白花蛇舌草总多糖对S180 移植性实体瘤的抑制作用及免疫器官的影响 见表3、表4。半枝莲和白花蛇舌草总多糖高、中、低剂量对S180 移植性实体瘤具有抑制作用，抑瘤率分别为37.81% 、27.36% 、21.19%；对S180 荷瘤小鼠的胸腺指数和脾脏指数均有不同程度的增加，与荷瘤对照组比较差异有显著性或非常显著性意义( P<><>180 移植性实体瘤具有抑制作用，同时还能增强机体的免疫力。
3.4 半枝莲和白花蛇舌草总多糖对S180 荷瘤小鼠体液免疫功能的影响 见表5。与正常对照组相比，荷瘤对照组小鼠的血清半数溶血素值降低( P<>180 荷瘤小鼠血清半数溶血素值显著增加( P<>180 荷瘤小鼠体液免疫功能的作用。
3.5 半枝莲和白花蛇舌草总多糖对S180 荷瘤小鼠网状内皮系统吞噬功能的影响 见表6。与正常对照组相比，荷瘤对照组小鼠的吞噬指数和吞噬系数降低( P<>180 荷瘤小鼠吞噬指数和吞噬系数显著增加(P <>180荷瘤小鼠网状内皮系统吞噬功能的作用。
4 讨论
多年来的动物实验和临床观察都表明，恶性肿瘤的发生、发展都伴随有机体免疫功能的降低，临床常以中药进行免疫调节，预防癌变，同时辨证辨病治疗恶性肿瘤。肿瘤细胞从原发灶转移到其他部位继续生长，乃是肿瘤威胁生命的重要原因。现代研究认为转移的肿瘤细胞具有免疫原低性和逃逸机体免疫功能的特点。因此，能够提高免疫功能的药物，也能抑制肿瘤细胞的生长。
白花蛇舌草和半枝莲二药主要功效为清热解毒，白花蛇舌草清热解毒兼消肿止痛，半枝莲清热解毒又具有化瘀活血作用，两药配伍用，可增强抑癌、排毒作用。本研究结果表明，半枝莲和白花蛇舌草总多糖有一定直接杀伤体外培养S180 瘤细胞株的作用。总多糖浓度为100µg/mL、200µg/mL和400µg/mL能够使在体G0/G1 期肿瘤细胞百分比增加，G2/M期肿瘤细胞百分比下降，对S期细胞百分比影响不大，提示主要抑制肿瘤细胞从G1 期向S期的转变。而环磷酰胺使G0 /G1 期和S期细胞百分比下降，G2/M期细胞百分比明显增加，说明主要阻止了G2/M期细胞向G1期的转变。总多糖高、中、低剂量对S180 移植性实体瘤具有抑制作用，抑制率分别为37.81% 、27.36% 、21.19%；使S180 荷瘤小鼠的胸腺指数和脾脏指数均有不同程度的增加，且呈现剂量效应关系。与荷瘤对照组相比，总多糖的高、中剂量组S180 荷瘤小鼠血清半数溶血素值显著增加。与荷瘤对照组相比，总多糖的高剂量组S180荷瘤小鼠吞噬指数和吞噬系数显著增加。关于半枝莲和白花蛇舌草总多糖抗肿瘤的具体作用机制，还有待今后的实验进一步研究探讨。
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