（选自《针刺研究》杂志2019-10期）
王俊英，高永辉，乔丽娜，张金铃，荣培晶，刘俊岭
(中国中医科学院针灸研究所，北京100700)
【摘 要】 目的：观察电针对颈部切口痛大鼠颈部脊髓中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-10(IL-10)和白细胞介素-4(IL-4)的影响，探讨电针对切口痛大鼠镇痛作用的抗炎机制。方法：SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、扶突组和足三里-阳陵泉组，每组21只。采用颈部甲状腺区域切口复制切口痛模型，电针组分别在手术时，术后20、44 h时电针“扶突”或“足三里”-“阳陵泉”治疗，30 min/次。采用甩尾测痛仪测定大鼠颈部甲状腺区域热痛阈值，采用免疫荧光法观察颈部脊髓背角TNF-α、IL-10表达变化，采用实时荧光定量PCR法观察TNF-α、IL-10、IL-4、IL-4R mRNA的变化。结果：与正常对照组比较，模型组各时点颈部切口区域痛阈值降低(P<0.05)。术后24 h，与模型组比较，扶突组颈部切口区域痛阈值明显升高(P<0.05)。术后24 h，与正常对照组比较，模型组TNF-α(主要表达在星形胶质细胞上)、IL-10的表达升高(P<0.05)，IL-4R mRNA的表达降低(P<0.05);与模型组比较，扶突组TNF-α、IL-10的表达显著降低(P<0.05)，IL-4和IL-4R mRNA的表达显著升高(P<0.05)，足三里-阳陵泉组TNF-α mRNA、IL-10 mRNA、IL-10的表达均显著降低(P<0.05)。结论：电针“扶突”穴对颈部切口痛的镇痛效应，可能与抑制颈部脊髓中TNF-α、促进IL-4/IL-4R的表达有关，并且电针“扶突”镇痛效应优于“足三里”-“阳陵泉”。
【关键词】 电针;切口痛;脊髓背角;炎性细胞因子
术后切口痛是临床常见的术后并发症，严重影响患者术后的生活质量。但使用麻醉药或镇痛药物对于患者尤其是老年患者的记忆力等都有明显的损伤。因此，很多医生与患者寻求非药物手段来缓解术后切口痛。针刺在甲状腺手术中具有降低麻醉药用量、术后止痛效果好、应激反应轻、并发症少等优点。近年来的研究发现，疼痛尤其是神经性疼痛与促炎状态有关。针刺可有效调节炎性因子，缓解疼痛。既往研究结果也表明，电针缓解病理性神经痛与其降低脊髓白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α等炎性因子有关。研究[7]证实脊髓背角细胞因子的水平与伤害性信息的传递关系密切。但是探讨炎性因子在针刺缓解颈部术后切口痛过程中作用的研究少见。因此，本研究拟在颈部切口痛大鼠模型上，观察电针与切口同神经节段的“扶突”及与切口不同神经节段的“足三里”-“阳陵泉”的镇痛作用以及对颈部脊髓TNF-α、IL-10、IL-4、IL-4R表达的影响，探讨电针对切口痛镇痛作用的抗炎机制。
健康清洁级雄性SD大鼠84只，体质量200~250 g，由中国医学科学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK(京)2014-0013。将大鼠饲养于室温(22±2)℃， 12 h/12 h明暗交替的环境中，自由饮水与进食。采用随机数字表法将大鼠分为正常对照组、模型组、扶突组和足三里-阳陵泉组，每组21只。所有大鼠进行行为学观察，其中每组5只用于免疫荧光观察，每组8只用于实时荧光定量PCR检测。所有实验方法遵守实验动物的福利伦理与“3R”原则并得到了中国中医科学院针灸研究所动物关怀和使用委员会的批准。
异氟烷(中国瑞沃德)，戊巴比妥钠(北京华业寰宇化工有限公司)，多聚甲醛(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)，TNF-α抗体、IL-10抗体、离子钙接头蛋白分子1(ionized calcium binding adapter mo-lecule 1，Iba-1)抗体(英国Abcam)，胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗体(美国Cell Signaling Technology )，Alexa荧光素594驴抗兔IgG、Alexa荧光素488驴抗鼠IgG、Alexa荧光素350驴抗小鼠IgG、Alexa荧光素488驴抗羊IgG(美国Life Technologies),Trizol总RNA提取试剂(天根生化科技有限公司)，PCR反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(日本Takara公司)。VME动物呼吸机(美国Matrix Company)，FV1200激光共聚焦显微镜(德国莱卡)，冰冻切片机(美国 Thermo)，针灸针(苏州医疗用品厂有限公司)，HANS-200A韩氏电针仪(南京济生科技有限公司)，疼痛甩尾仪(意大利UGO Basile)，ABI 7500实时荧光定量PCR系统(美国Applied Biosystems)。
异氟烷吸入麻醉大鼠后，沿颈部正中线经皮肤和肌肉作1.5 cm的纵行切口，暴露甲状腺，然后用镊子沿着甲状腺区域周围的双侧胸骨舌骨肌反复钝性剥离刺激30 min后缝合。
参照《实验针灸学》中大鼠标准穴位图谱定位，“扶突”穴位于胸锁乳突肌胸骨支与锁骨支之间，胸锁乳突肌中部，第4颈椎平面上;“足三里”位于大鼠后肢膝关节后外侧，腓骨小头下约5 mm处;“阳陵泉”位于“足三里”上外侧5 mm。
在颈切口手术中、术后20 h和术后44 h，在异氟烷轻度麻醉下给予电针干预,针刺双侧“扶突”或“足三里”-“阳陵泉”，连接韩氏电针仪，刺激强度为1 mA, 频率2 Hz/100 Hz，30 min/次。对照组和模型组采用相同方法麻醉，但无电针刺激。
热痛阈值检测：采用甩尾测痛仪分别在甲状腺区切口术前，术后4 、24、48 h检测颈部切口区域的热痛阈值。辐射热灯聚焦在颈部切口区域的中央，当大鼠迅速地将脖子从热源移开时，记录颈部热刺激反应潜伏期为大鼠的热痛阈值。为了避免潜在的组织损伤，将辐射热辐射的截止时间设置为30 s。测量重复3次，每次间隔5~10 min，取3次平均值。
免疫荧光染色检测颈部脊髓背角TNF-α、IL-10表达：每次热痛阈检测结束后即进行数据统计学处理，当治疗干预组的痛阈值有明显改善时进行脊髓样本取材。每组随机选取5只大鼠深度麻醉，采用4%多聚甲醛灌流固定，取大鼠颈(C)2—C5段脊髓，30%蔗糖脱水。采用冰冻切片机切片，片厚40 μm，加入TNF-α一抗(1∶500)和GFAP一抗(1：1 000)或IL-10一抗(1:500)和GFAP一抗(1:1 000)及Iba-1一抗(1:500)，4 ℃过夜，加入不同荧光素标记的相应二抗室温孵育2 h，裱片，封片。每只大鼠随机选取3张切片进行激光共聚焦显微镜观察，每张切片随机选取5个视野进行荧光强度测量，取其均值为一张切片的TNF-α或IL-10的荧光亮度，取3张切片的均值为一只大鼠的平均荧光强度。
实时荧光定量PCR法检测颈椎脊髓背角TNF-α、IL-10、IL-4、IL-4R mRNA表达：大鼠深度麻醉后，取颈部脊髓C2—C5背侧部分(半切)，放入液氮中保存，每组8只。采用Trizol总RNA提取试剂盒进行脊髓样本总RNA提取，按照反转录试剂盒操作步骤将RNA反转录为cDNA，配置荧光定量PCR反应体系，加到96孔板对应的每个孔中，置于荧光定量PCR仪上进行PCR扩增，反应条件：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s 40个PCR循环。扩增反应结束后，95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s;从60 ℃缓慢加热到99 ℃产生熔解曲线。每个样本检测3个复孔。数据采用2-△△Ct法进行分析。引物序列见表1。
所有数据使用SPSS20.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差(±s)表示，各组间在手术后各个时间点比较采用单因素方差分析，方差齐时多重比较采用LSD检验，方差不齐时采用Dunnett’s T3检验。P≤0.05为差异有统计学意义的标准。
由图1可见，术前各组大鼠热痛阈值差异无统计学意义(P>0.05)，术后4 h，模型组、扶突组和足三里-阳陵泉组颈部切口区热痛阈值均较正常组显著降低(P<0.05)。术后24 h，与正常对照组比较，模型组颈部切口区痛阈值仍显著降低(P<0.05);与模型组比较，扶突组的痛阈值显著升高(P<0.05)。术后48 h，与正常对照组比较，模型组颈部切口区痛阈值仍显著降低(P<0.05);与模型组比较，扶突组和足三里-阳陵泉组痛阈值略有升高(p>0.05)。根据热痛阈的结果，术后24 h各组痛阈值表达差异显著，电针不同穴区效应差异显著，因此以术后24 h脊髓背角炎性和抗炎因子的变化为观察的重点。
2.2 各组大鼠脊髓背角TNF-α表达比较
由图2可见，术后24 h，与正常对照组比较，模型组TNF-α的免疫荧光强度和TNF-α mRNA相对表达量显著升高(P<0.05)。与模型组比较，扶突组TNF-α的免疫荧光强度和TNF-α mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)，足三里-阳陵泉组TNF-α mRNA的相对表达量显著降低(P<0.05)。
GFAP为星形胶质细胞的标记物。术后24 h，正常对照组星形胶质细胞处于未激活状态，TNF-α与星形胶质细胞有少量的共表达(黄色)。模型组的星形胶质细胞明显激活，胞体变粗，星形突起增多增大，且呈爆炸式生长，胞体亮度明显增强，TNF-α与GFAP的共表达增多。扶突组TNF-α与GFAP有少量共表达;足三里-阳陵泉组TNF-α与星形胶质细胞的共表达仍较多。见图3。
2.3 各组大鼠脊髓背角IL-10表达比较
由图4可见，术后24 h，与正常对照组比较，模型组IL-10免疫荧光强度和IL-10 mRNA的相对表达量显著升高(P<0.05)。与模型组比较，扶突组和足三里-阳陵泉组IL-10免疫荧光强度和IL-10 mRNA相对表达量均显著降低(P<0.05)。
图5可见，术后24 h，正常对照组中IL-10与星形胶质细胞有少量的共表达情况，模型组和两电针组均没有观察到IL-10与星形胶质细胞明显的共表达。
图6可见，正常对照组IL-10与小胶质细胞有少量共表达;模型组IL-10与小胶质细胞没有明显的共表达;扶突组和足三里-阳陵泉组IL-10与小胶质细胞在脊髓背角Ⅱ层有少量的共表达。
2.4 各组大鼠脊髓背角IL-4的表达变化
由图7可见，术后24 h，与正常对照组比较，模型组IL-4R mRNA的相对表达量显著降低(P<0.05)。与模型组比较，扶突组的IL-4 mRNA和IL-4R mRNA的相对表达量均显著升高(P<0.05)。与扶突组比较，足三里-阳陵泉组IL-4 mRNA 和IL-4R mRNA的相对表达量均显著降低(P<0.05)。
疼痛可以分为伤害感受性疼痛和神经病理性疼痛(或两类的混合性疼痛)。术后痛为伤害感受性疼痛，属急性疼痛的一种，一般在术后24~48 h出现高峰期，严重影响患者的术后生活质量。
炎性介质如细胞因子、趋化因子可导致血管通透性增加，并增加疼痛的敏感性和疼痛受体的表达。有临床研究证实，神经病理性痛患者的T细胞亚群有向抗炎转变的趋势。动物实验也表明神经病理性痛与脊髓内炎性因子的含量有关。大鼠切口痛模型复制后，疼痛可能伴随切口部位炎性因子如IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的表达升高，核因子kappa-B(NF-κB)的激活。在大鼠尾部做手术切口后，术后2 h可发生机械痛觉过敏，持续6 d，损伤部位组织内IL-1β、IL-6、TNF-α在术后增加，但是血清内炎性因子的含量与术后痛觉敏感无相关性。
本研究观察到在颈部切口术后，切口局部辐射热痛阈值显著降低。术后24 h颈部脊髓中TNF-α和IL-10的表达显著升高，IL-4 mRNA表达略降低，IL-4R mRNA的表达显著降低。颈部切口损伤后，大鼠在致炎因子TNF-α的作用下，调动机体自身的免疫机制，相应引起IL-10的表达升高。在大鼠脊髓钝挫伤时，脊髓损伤早期(术后1 d)IL-10表达增高，抑制脊髓组织的炎性反应，减轻组织损伤。切口损伤后24 h，颈部脊髓背角胶质细胞呈被激活的状态，TNF-α与星形胶质细胞的共表达也较多，可能是由于TNF-α的升高激活了胶质细胞，而激活的星形胶质细胞又可以释放TNF-α。IL-10可由巨噬细胞或胶质细胞(小胶质细胞和星形胶质细胞)产生，但本研究中未观察到切口损伤后IL-10与胶质细胞的明显共表达，故增多的IL-10可能不是来源于胶质细胞。生理状态下，机体中以TNF-α为代表因子的辅助性T细胞(Helper T cell，Th)1细胞与以IL-4、IL-5为代表因子的Th2细胞处于平衡状态。Th1/Th2的平衡变化是体内炎性反应与抗炎反应免疫平衡变化的基础，Th1细胞分泌的促炎因子TNF-α和Th2细胞分泌的抗炎因子IL-4的含量变化是Th1/Th2平衡变化的表现之一。因此本研究中颈部切口痛后，促炎细胞因子TNF-α激活NF-κB导致不同的炎性基因的激活[13];Th1/Th2升高，抑制Th2 (IL-4、IL-5)类细胞因子优势表达，以及IL-4R降低，引起免疫失衡。
针灸对大部分疾病的调控都可以调动包括免疫因子在内的机体免疫调节系统，抑制致炎因子(IL-1β、TNF-α等)的表达，降低炎性级联反应，促进损伤修复。电针“足三里”可降低炎性反应疼痛大鼠血清TNF-α、IL-1的含量，从而缓解机体的炎性反应。既往研究也表明，电针缓解神经病理性疼痛引起的痛觉敏感与调节胶质细胞和炎性因子有关。本研究的结果表明，扶突组缓解颈部切口痛优于足三里-阳陵泉组。电针治疗后，降低了脊髓TNF-α和IL-10的表达，可能是电针缓解了机体的炎性反应。有报道观察到，针刺麻醉可显著降低患者手术时和手术后血清IL-10的表达。有动物实验观察到，针刺治疗慢性变应性鼻炎可降低血浆IL-10水平。有学者认为针刺治疗疾病后IL-10水平的下降，可能是由于针刺引起了向Th1转变的免疫反应或者对损伤诱导的微环境的抗炎作用。
总之，本研究表明，电针“扶突”后，胶质细胞的活化降低，TNF-α与星形胶质细胞的共表达减少，而电针“足三里”-“阳陵泉”后TNF-α与星形胶质细胞仍有较多共表达，说明电针“扶突”的镇痛作用与星形胶质细胞分泌TNF-α有关。但电针后IL-10减少的情况下，IL-10与小胶质细胞仍有少量的共表达，这可能是由于电针诱导脊髓背角的小胶质细胞分泌了IL-10，其机制还不清楚，故电针后中枢神经系统胶质细胞与炎性因子介导的免疫系统的交互作用还需进一步研究。
联系客服
