戏说抗体和蛋白药物的免疫原性

Q

作者介绍

孙乐，京天成公司总裁，拥有26年的抗体研制经验，其28天成功开发出鼠单抗的记录至今无人能破。京天成已经为国内外客户针对几十种抗体药和蛋白药研制过Anti-Id鼠单抗和猴多抗，并成功地开发出ADA评价试剂盒。京天成还可以利用保密的软件帮助客户分析生物药或蛋白药候选物中线性抗原位点，并通过小鼠和猴子实验来评估免疫原性（包括ADA和T细胞反应）。

免疫原性的

为什么一夜之间，蛋白药/抗体药的免疫原性突然成为热门话题，被戏称为让生物医药公司CEO寝食难安的深水炸弹？美国FDA官员在巴尔的摩举行的”Immunogenicity& Bioassay Summit”上从三个不同的角度回答了这个问题：

• 对病人、医生和医保来说，免疫原性影响了药物的安全性和有效性、甚至会因为ADA和内源蛋白交叉给病人带来致命的新疾病，人财两空；

• 对企业来说，研发风险大大增加、病人流失，更要命的是现在的预测手段不好，结果到了临床III期才发现ADA问题，损失惨重；

• 对药监部门来说，免疫原性成为FDA的头等大事，所有生物药上市前必须有免疫原性评价来确保药物的安全性和有效性。具体见下图。
  

FDA悲观地认为几乎所有的生物药迟早都会产生抗药抗体(Anti-drug antibody, ADA)。二十年前，我们这些做抗体药研发的人都非常乐观地告诉潜在投资人，抗体药不会像小分子药那样产生抗药性，所以我们的病人会一辈子都用我们的药。今天我们再也不敢说了，因为小分子药的抗药性是细胞水平上的，需要DNA突变等慢慢变异，而大分子药的抗药性是在免疫系统水平上的，有的病人在给药后1-5天就产生了ADA。接受阿达木抗体药治疗的IBD病人，每年24%的失效率，具体见下图。

2009版的FDA有关蛋白药临床前免疫原性评价的要求还是很松的，药企和监管部门都认为动物体内的免疫原性数据不能预测人体内的反应。但是，2012年诺和诺德的长效重组FactorVII在临床III期时发现11%的病人不仅产生了ADA，而且有一半竟然和内源蛋白交叉，病人面临凝血障碍的生命威胁，被马上叫停。后来检讨发现原因是是临床II期给药次数不够，不足以发现内在的免疫原性，具体见下图。

2016版FDA有关蛋白药免疫原性评价方法学建设和验证指南讨论稿则画风大变，把免疫原性一下子归到了药物的副作用一栏。

最近，辉瑞因为免疫原性更强、注射点反应更严重，中和ADA使疗效逐渐下降，宣布终止其PCSK9抗体Bococizumab的6个临床III期（2万多病人），直接损失几亿美元，股价也大跌约40亿美元。这颗深水炸弹确实杀伤力太大，我想大公司的CEO再也不抱临床上病人可能不会产生ADA的侥幸心理！

免疫原性的产生原因

免疫原性来源分为内源和外源两类。

内源的来自非人源氨基酸序列（比如鼠源抗体、蛇毒等，这个大家都容易接受）、不同人的氨基酸序列（这个比较难接受，不过想想A型血不能输给O型血也就明白了）、和为了加强功能或延长半衰期人为引进的（点突变、糖基改动、加脂肪酸、去海藻糖、PEG化、Fc融合、双特异\多功能和ADC）。

诺和诺德的长效FactorVII就是引进了3个氨基酸点突变，结果是性情大变，具体见下图。内源的免疫原性需要我们在药物研发的早期就应该考虑进去。辉瑞的一个做免疫原性评价的博士在做报告时说“做早期R&D的人终于肯让我们说几句话了”。似乎赢得这个话语权的代价有点太高！

外源的则是和CMC，甚至物料和运输等相关。为了降低成本需要提高抗体表达量，结果糖基化没有跟上，导致了多聚体产生。而免疫学家公认多聚体是免疫原性的一个主要起因，更要命的是后面的抗体生产工艺里面没有任何一步能够把多聚体去除。生物药分子上的半乳糖和宿主细胞残留中的半乳糖，有可能会诱导抗半乳糖的抗体，使病人对动物制品和食品过敏。同时病人体内已经存在的半乳糖抗体也会降低抗体药的疗效，故也有必要对病人进行Pre-existing抗体筛查。蛋白药的Oxidation和De-amidation也会诱导ADA，只是对抗体药影响可能不是那么大。

生物药的制剂也会成为免疫原性的来源，比如常用的表面活性剂，它们对人和动物的免疫系统刺激比我们做抗体用的免疫佐剂石蜡油还要厉害，故也不能轻易改动。Avonex是每瓶一剂的Interferon-β,而Betaseron是每瓶五剂的Interferon-β。就是因为后者要比前者溶解后分批使用多摇几次，结果多聚体增加了差不多三倍，中和活性Nab的发生率增加了十倍，具体见下图。Betaseron最后只能退市。

免疫原性需要具体问题具体分析

生物药有免疫原性，并不意味着一定会诱导病人产生免疫反应。比如作为Thirdline treatment的Erbitux，它在健康猴子里的ADA是非常的高，但是治疗的病人则是本来免疫功能就不好（否则可能也不会得癌症），再加上化疗和放疗都接受过，病人的免疫系统几乎被彻底摧毁了，怎么还会产生显著的ADA？故Erbitux和Avastin的ADA发生率都非常低。反过来，患有自身免疫疾病的病人，它们的免疫系统就像国庆节期间的北京，高度警惕，哪怕有一点点免疫原性也会放大很多倍。

刚刚出炉的Amgen做的阿达木生物类似药数据表明，在临床I期健康人中，ADA为43-51%，但是在Psoriasis病人里则是68-74%。为了抑制阿达木诱导的ADA，他们在给RA病人阿达木的同时，注射了免疫抑制剂MTX，结果ADA降到38%，具体见下图。我们在临床前的健康猴子里观察到的阿达木ADA为45.3%，和健康人的数据非常近吧，猴子和人没有太大差异，不要再欺负它们不会申辩了。当然，健康动物或健康人群的ADA数据必须加上一个病人免疫体系影响因子来预测病人中的免疫反应强度。

另外，病人对生物药的免疫反应还取决于给药途径、剂量和频率。皮下注射(s.c.)会有最强的反应，而静脉注射（i.V.）则是最弱。单次注射产生IgM为主，多次注射14天后以IgG为主。给药间隔越长，ADA的亲和力越高，这就像我们打疫苗一样。病人的从药性提高了，药效有可能下降很快。FDA强调，药物研发是一个系统工程，免疫原性关注必须贯穿这个药物研发和上市后，具体见下图。千万不要顾东忘了西！

免疫原性的分析

免疫原性或者直接说ADA怎么分析？FDA指南说分步来：

• 筛查试验（Screening assays）: 检测出识别蛋白药的抗体（结合抗体BAb)，是ADA评价的第一步；

• 确认试验（Confirmatory assays） : 用蛋白药竞争来确认筛查到ADA是否特异；

• 滴度评价试验（Titreing assays） : 评价确认阳性样品中ADA的强度；

• 中和试验（Neutralization assays） : 评估ADA的抗药性，中和抗体只是结合抗体的一部分。这次特别强调必须用体外细胞中和实验，除非你能够证明给他们看体外实验做不了。“The impact of ADA on safety and efficacy may correlate with the titers and NAb activities rather than the incidence.”

指南要求我们高度重视这个风险，还专门解答了ADA方法学建设和验证的时间点。怕我的翻译不准确，直接把它们的原话摘录如下：

FDA recommends a risk-based approach, preferably at the IND stage, during Phase I.

1. If immunogenicity poses a high clinical risk     (such as non-endogenous protein drugs), the sponsor should implement pre-validated assays early, before and during Phase I, and obtain data in real-time by analysis of the samples before banking.

2. In lower risk cases, the samples can be banked till the suitable assays are available.

3. In pivotal trials, test with fully validated assays.

For license application, provide the data supporting fully validation of the assays.

FDA官员在会议上多次强调，我们的大门是一直对企业敞开的。在启动临床之前，不清楚或不确认你的生物药是属于高风险还是低风险的，请来和我们沟通。如果是高风险的项目，你一旦把病人血清冻存了就作废了。风险越大、分析方法开发越要早。

另外，还有几个细节上的问题，我想借此机会提醒大家。一个是抗-抗体药的标准品和质控品。标准品是用来确定检测限（LOD）的，FDA建议用抗体药可变区（不是Fab）特异性的单抗（多株最好）。之前有客户委托我们用抗体药的Fab去免疫兔子，然后用全长抗体药做免疫亲和纯化获得亲和纯化多抗，错误地以为这些抗体就是抗体药特异的。其实不然，我们有实验数据证明这样制备的多抗里面，90%以上的抗体是识别Fab里面的残留Fc序列和4个FR序列的，并非是你的抗体药特异的。如果你把这样的抗体稀释在1%的猴或人阴性血清里面，你的LOD会比你把它们稀释在3%BSA里面差几十倍。质控品则建议用抗体药在佐剂帮助下免疫猴子来获得，因为我们要检测的是给药后猴子或人的多克隆ADA。前面提到的ADA单抗识别的只是抗体药上面的一个位点、一个亲和力，和给药后动物体内的ADA可比性很差，最理想的阳性对照是给药后病人的血清，但是这是几乎不可能拿到的。

另外一个就是在评价小鼠注射抗体药产生ADA的滴度时，一定要用含有1%正常人血清的稀释液来稀释小鼠血清，把针对抗体药中人抗体共有序列/表位的鼠多抗给封闭掉，你会惊喜地发现不同的人源化或全人源抗体药在小鼠中诱导ADA的能力是很不一样的。

附 已上市抗体药物免疫原性统计

参考资料

• U.S.Department of Health and Human Services, et al. 2016, Guidance for Industry, Assay Development and Validation for Immunogenicity Testing of Therapeutic ProteinProducts. Available at http://www.fda.gov/RegulatoryInformation/Guidances/default.htm

• Pedras-VasconcelosJA, Office of Biotechnology, OPQ/CDER/FDA. FDA Regulatory Perspectives onImmunogenicity-An Update, CHI Immunogenicity & Bioassay Summit, 2016.

• HalletW, DBRRII/OBP/OPQ/CDER/FDA. Impact of Aggregates on Immunogenicity of ProteinTherapeutics: A Regulatory Perspective” CHI Immunogenicity & BioassaySummit, 2016.

• HicklingT, Pfizer. Working with Protein Engineers to Predict and Pre-EmptImmunogenicity of BioTherapeutics” CHI Immunogenicity & Bioassay Summit,2016.

• WeldinghKN, Novo Nordisk. rFVIIa Analogue Clinical Trial including 3 year follow up inpatenits with Anti-Drug Antibodies. CHI Immunogenicity & Bioassay Summit,2016.

• BarteldsGM, Krieckaert CL, Nurmohamed MT, van Schouwenburg PA, Twisk WF, Dijkmans BA,Aarden L, Wolbink GJ. 2011, Development of antidrug antibodies against adalimumab and association with disease activity and treatment failure duringlong-term follow-up. JAMA 305(14), 1460-1468.

• GarcesS, Demengeot J, Benito-Garcia E. 2012, The immunogenicity of anti-TNF therapyin immune-mediated inflammatory diseases: a systemic review of the literaturewith a meta-analysis. Ann Rheum Dis 0, 6-9.

• U.S.Department of Health and Human Services, et al., 2009, Guidance for Industry Assay Development for Immunogenicity Testing of Therapeutic Proteins. Available at http://www.fda.gov/AnimalVeterinary/GuidanceComplianceEnforcement/GuidanceforIndustry/default.htm

欢迎加入小编团队成为小编一员

请加 小编微信号：wuwenjun7237

如有技术解读、行业洞见愿意分享