军团菌检测方法

　  军团菌概况

　　军团菌是一种环境感染性致病菌，可引起急性呼吸道传染病，即军团菌病。军团菌分布极其广泛，医院、酒店等的供水系统、空调的冷却系统等各种水源均易于滋生、污染军团菌，并造成军团菌病传染的风险。即与水有关的地方均可能存在军团菌。

　　军团菌传播、感染有以下特点：

　　1、透过空气、水份感染，传播带季节性，超过50%病例在夏季发生。

　　2、滋生在医院、酒店的供水系统，通过过水龙头、浴室传播。

　　3、可通过空调的冷却系统，由通风口传播并感染对象。

　　军团菌属革兰氏阴性杆菌，专性需氧，无芽孢，无荚膜，军团菌需要半胱氨酸和铁，无半胱氨酸时，军团菌无法生长。生化特征还有不发酵也不氧化糖类，不还原硝酸盐，氧化酶实验阴性或弱阳性，尿素酶阴性，军团菌生长的最适pH为6.9-7.0，2%-5%CO2能促进部分菌株的生长。军团菌生长缓慢，易于被其它菌落覆盖。军团菌的菌落颜色多样，通常呈白色、灰色、蓝色或紫色，也能显深褐色、灰绿色、深红色。菌落整齐，表面光滑，在紫外灯下，有荧光。目前军团菌分为64种血清型及42个种。

　　ISO11731水样中军团菌检测方案

　　采样：一般用玻璃或聚乙烯等无菌容器采样。如果水样中含有消毒剂，需在采样前或采样后加入中和剂，含氯或氧化型消毒剂可用硫代硫酸钠或硫代硫酸钾作中和剂。水样应当天检测为佳。

　　样品富集：如果样品中军团菌的数目预计多于105cfu/L，直接取样涂布于GVPC平板上分离培养检测。如果样品中军团菌的数目未知或较少时，一般采用滤膜法或离心法富集军团菌。

　　滤膜法：将水样以0.22μm滤膜过滤浓缩，然后加入5ml无菌水，超声波振动混匀3min后为浓缩样品。

　　离心法：将水样置于高速离心机中，6000g离心15min，(15℃-25℃)，弃去上清，然后加入2ml-10ml无菌水，混匀后为浓缩样品。

　　样品处理：将浓缩样品分三份，一份直接取样涂布于GVPC平板上分离培养。一份酸处理：2ml浓缩液+2ml缓冲液(0.2mol/L的HCl 3.9ml+ 0.2mol/L的KCl 25ml,KOH溶液调pH2.0±0.2)，摇匀5±0.5min。取样涂布于GVPC平板上分离培养。一份热处理：2ml浓缩液于50±1℃水浴30±1min。即三种处理方法的结果分别取样涂布于GVPC选择性平板上培养分离。

　　革兰氏染色：军团菌生长较慢，次日生长的菌落可直接弃去。军团菌菌落颜色多样，通常呈白色、灰色、蓝色或紫色，也能显深褐色、灰绿色、深红色。菌落整齐，表面光滑，在紫外灯下有荧光。军团菌为革兰氏阴性杆菌。

　　菌落验证：从每个平皿上选几个可疑菌落，接种BCYE、BCYE-Cys平板和血平板进行传代培养，凡在BCYE平板上生长，而在BCYE-Cys平板上不生长的菌极可能是军团菌。

　　军团菌计数：从三个GVPC平板中选择确证菌数最多的平板进行计数，再除以浓缩倍数，作为军团菌数的估计值。

　　鉴定：对于极可能是军团菌的菌落可作血清分型、生化或PCR等鉴定实验。