3. 抗体
T. 做细胞信号传导,要做磷酸化某因子Western Blot,其二抗有何要求?
解答:对二抗无要求,要看你实验条件来选择,一般推荐用HRP标记的二抗。
U. 同一公司的另外抗体用这个稀释度做出来效果很好,所以没做预试,怕费时间,用什么样的稀释度比较好呢?我用的ELL+plus试剂盒显色。转膜过夜,一抗孵育也是过夜的,若封闭也过夜的话就要四天才看的到结果了。
解答:不同抗体,即使是同一公司的抗体,其最佳的抗体稀释度也是不一样的,需要你实验摸索。我觉得转膜过夜好像没有必要吧,转膜的目的也就是将蛋白转到膜上就行啦,何必浪费时间呢。至于具体的转膜时间,还要看你的目的蛋白分子量的大小;转膜的设备,是半干式,还是湿式。一抗当然可以过夜,如果你想所短Western Blot时间的话,可以增高一抗的孵育温度,我们实验室一般37度,两小时就足够了;你可以参照抗体说明书。至于一抗和二抗得稀释度,你可以一抗1:1500;二抗1:20000试试。另外建议你洗膜时,多洗几次,最好是在封闭;一抗和二抗后至少是5x5min,跑一张好膜不容易,多尽点心吧,这样不会浪费你的时间,只会节省你的时间!
V. 免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗?
解答:免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇(又称表位),有些表位是线性的,而有的属于构象型;线性表位不受蛋白变性的影响,天然蛋白和煮后的蛋白都含有;构象型表位由于受蛋白空间结构限制,煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸,也就是线性表位,那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western,而如果抗体识别构象形表位,则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。(限于单抗)
W. Western Blot 中抗体的重复应用问题
解答:抗体工作溶液一般不主张储存反复使用,但是如抗体比较珍贵,可反复使用2-3次。稀释后应在2-3天内使用,4度保存,避免反复冻融。
4. 滤纸、胶和膜的问题
X. NC膜\ PVDF膜\ 尼龙膜怎样鉴别?
解答:尼龙膜是较理想的核酸固相支持物,有多种类型;硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物,价格最便宜;PVDF膜介于二者之间。
就结合能力而言:尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480-600μg/cm2,可结合短至10bp的核酸片段;硝酸纤维素膜结合DNA和RNA能力可达80-100μg/cm2,对于200bp的核酸片段结合能力不强;PVDF膜结合DNA和RNA能力可达125-300μg/cm2。
就温度适应性而言:尼龙膜经烘烤或紫外线照射后,核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合;硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA,结合不牢固;PVDF膜结合牢固,耐高温,特别适合于蛋白印迹。
就韧性而言:尼龙膜较强;硝酸纤维素膜较脆,易破碎;PVDF膜较强。
就重复性而言:尼龙膜可反复用于分子杂交,杂交后,探针分子可经碱变性被洗脱下来;硝酸纤维素膜不能重复使用;PVDF膜可以重复使用。
Y. 在做Western Blot时,PBDF膜用甲醇浸泡的目的?
解答:PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团,使它更容易跟带负电的蛋白质结合,做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。
Z. 检测磷酸化的JNK 和非磷酸化的JNK可以在同一张膜上吗?
解答:可以。
AA. 转膜后经丽春红染色的条带,为什么大蛋白分子的一端(即点样空的一侧)的转膜好象不是很好,为什么?
解答:这是正常的,大分子的蛋白转移的慢, 你延长转移时间和电流,大分子一端就会好的多,但是小分子的就有可能会变淡。
BB. 我想问您裂解细胞用三去污裂解法,还是用上样缓冲液?
解答:用上样缓冲液,这样有几个好处,可以提取总蛋白,同时又可以让磷酸化酶失活。
CC. 采用tank system有什么讲究?
解答:建议低电压,长时间,(一般tank System 用衡压好点),如 28V 14-16hrs。
DD. 做HSP WESTEN定量,同样的抗体免疫组化能做出,而WESTEN却不能?
解答:这多半是抗体的问题,要看抗体的说明,是否能做Western Blot和IHC。
EE. 膜一般要如何处理?
解答:一般用甲醇泡泡就可以了。
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