阿尔茨海默病（AD）领域又迎来了一个坏消息。
6月16日，罗氏和班纳阿尔茨海默病研究所共同宣布，靶向Aβ的单克隆抗体crenezumab在认知正常的常染色体显性AD患者中的预防性试验没有达到既定终点[1]。在继治疗早期AD的CREAD I和CREAD 2试验失利后，在NIH资助的这项研究中，crenezumab再次折戟，恐怕这次会成为这款药物的悲情谢幕。
在抗Aβ药物治疗中早期AD连番失利之后，科学界一个普遍的灵魂拷问是：我们是不是治得太晚了，如果在Aβ大量沉积之前就干掉它，结局会不会不一样？但crenezumab这次试验的结果无疑又让我们捡起了那个古老的灵魂追问：Aβ这个靶点到底行不行？在整个AD的病因链条上，Aβ究竟处在哪一级？
而近期，《自然·神经科学》的一篇重磅封面文章几乎以拨云见日的力度，给了我们意想不到的答案。
在这项研究中，科学家得到了几个重要发现[2]：
第一，此前在AD中发现的自噬障碍不是Aβ沉积的下游事件，而是上游事件，也就是说，先有自噬障碍，再有Aβ沉积；
第二，此前主流观点认为，Aβ沉积主要在神经元细胞外，但此次研究发现，在疾病早期，Aβ主要沉积在神经元细胞内；
第三，研究首次观测到，处于自噬应激压力下的神经元，呈现出绮丽的「毒花」景观，而最终在大脑中观测到的淀粉样老年斑，实则是这些「毒花」神经元死亡后的「遗骸」！
大家先平复一下心情，然后我们来详解一下这个研究。
这项研究的第一作者是美国内森·克莱恩研究所痴呆症研究中心的Ju-Hyun Lee，通讯作者是Ralph A. Nixon。两位在AD和自噬领域都做了大量的研究。
自噬和AD并不是首次牵手，两者之前的恩怨情仇其实由来已久。
以往已经有大量的研究显示，阿尔茨海默病中存在显著的自噬损伤，说明自噬和AD无论如何都是有一腿的。而来自罕见病的研究显示，损害自噬或溶酶体功能的突变可以在人类体内造成神经退行性疾病[2]，说明自噬有直接导致神经退行性疾病的潜力。
虽然有一些蛛丝马迹，但自噬和AD在分子基础和病理学上究竟是什么关系，以往研究并没有搞清楚。不过主流观点认为，自噬障碍，是Aβ在神经元细胞外沉积的下游事件，是Aβ触发的一系列结果之一。大白话就是，Aβ是大魔王，自噬障碍不过是大魔王干的坏事儿之一。
而本次研究，则对这些传统认识发起了猛烈冲击。
要搞清楚自噬和AD啥关系，就需要有一个观测大脑中自噬过程的好方法。
为了监测AD病理中的自噬过程，研究团队开发了一种双荧光探针，同时动用了若干高端的成像方法。为了理解这个探针的工作原理，我们先来简单复习一下自噬的一些基础知识。（后面的研究方法搞不太懂也没有关系，可以直接穿越看结论）
我们知道，自噬在细胞体内发挥着类似“清道夫”的功能。具体实现方式分为三种类型：巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬。在巨自噬过程中，有几个关键步骤，双层膜形成自噬小泡→自噬小泡捕获需要降解的细胞器或蛋白质形成自噬体→自噬体与溶酶体结合→形成自噬溶酶体。在这个过程中，LC3蛋白会和自噬体结合，因此LC3蛋白也可以作为一种自噬的示踪剂。
荧光显微镜mRFP-eGFP-LC3融合蛋白示踪是研究自噬的常用方法。mRFP是稳定的荧光表达基团，显示红色；GFP是酸敏感型蛋白，显示绿色。
当自噬体和溶酶体未融合时，红绿两种荧光都显示，融合后是黄色。当自噬体和溶酶体融合后，如果溶酶体酸性环境正常，则GFP淬灭，仅显示红色；如果酸化不足，GFP不淬灭，显示黄色。
为了区分黄色荧光是溶酶体酸化不足，还是没有结合溶酶体，研究团队还对溶酶体进行了蓝色标记。两者未结合显示黄色，结合后酸化正常，红+蓝显示紫色，结合后酸化异常，红绿蓝融合显示白色。
在这项研究中，研究人员培育了一种可以让mRFP-eGFP-LC3在神经元中特异性表达的TRGL小鼠，然后再将TRGL小鼠与AD模型小鼠Tg2576杂交，培育出可以监测自噬进程的AD小鼠模型。使用这个小鼠模型，研究团队得到了以下两个重要的发现。
❗第一，在发展出Aβ斑块之前，小鼠的神经元中就已经出现了自噬障碍，而这种自噬障碍是溶酶体酸化不足造成的。在疾病早期，Aβ在酸化不足的自噬溶酶体内聚集。
研究观察到，小鼠5个月时，超过90%的新皮质III–V层核周体内，除了酸化的自噬溶酶体之外，还出现了酸化不足的自噬溶酶体（pa-AL），而且Tg2576/TRGL中pa-AL比TRGL小鼠多四倍。
要知道，Tg2576小鼠一般在10~12个月发展出Aβ斑块。这说明在Aβ斑块出现之前，AD模型小鼠神经元中就已经出现了因酸化不足导致的自噬障碍。
进一步，研究人员发现了自噬溶酶体酸化缺陷的原因：与野生型同窝仔小鼠相比，6个月大的AD小鼠溶酶体和自噬溶酶体中 vATP 酶活性降低，而vATP 酶是维持溶酶体酸性环境的关键。
除此之外，研究人员还发现，5个月时，Tg2576/TRGL小鼠中40%的III-V层新皮质周核含有Aβ/APP-βCTF阳性聚集点，基于 CTSD标记，这些聚集点几乎都在于pa-AL中。几种方法均验证，早期Aβ是在pa-AL内沉淀。也就是说，在疾病早期，Aβ是沉积在神经元内的。
❗第二，在巨大的自噬应激压力下，大量Aβ阳性消化不良的自噬体聚集在神经元内形成了绮丽的「毒花」；而最终在大脑中观测到的淀粉样老年斑，实则是这些「毒花」神经元死亡后的「遗骸」！
随着疾病的进程，Aβ不断在pa-AL内沉淀。在10个月大的Tg2576/TRGL小鼠中，新皮层神经元亚群（III-V 层）开始积累显著增大的 pa-AL，并使质膜向外凸出。
大量含有Aβ的pa-AL在神经元周核聚集，形似花朵，形成了一种奇异的自噬应激形态，研究人员将其称为「毒花」（PANTHOS）！这也是科学家首次在AD模型中观测到这种形态。
那么，这些Aβ阳性的「毒花」是否为Aβ沉淀的主要形态呢？研究发现，在年轻的AD小鼠模型中，用Aβ抗体检测到的Aβ核心斑块，与显示在中央核的PANTHOS神经元几乎1:1重合。
为了表征PANTHOS神经元向成熟斑块的演变，研究团队用硫黄素 S (Thio-S) 对PANTHOS进行免疫标记，以检测致密的老年斑块。在2.2个月大的模型小鼠定量分析中，一半的PANTHOS谱为Thio-S阳性，而在6个月大时， 超过95%为Thio-S阳性。
PANTHOS神经元具有免疫原性，会召集小胶质细胞或星形胶质细胞入侵神经元，导致神经元的死亡，将神经元内的淀粉样蛋白病变转变为细胞外淀粉样蛋白斑块。在小鼠6个月时，大量PANTHOS神经元表现出结构完整性的丧失，并被两种胶质细胞结合。除此之外，由于溶酶体碱化可促进溶酶体膜透化，将组织蛋白酶释放到细胞质中，促进神经元细胞死亡。
在较老的小鼠中，相邻的PANTHOS神经元合并成一个包含多个Thio-S阳性致密核心的单个较大斑块，随着病变的不断扩大，最终形成了细胞外致密核心老年斑。由此看来，在大脑中观测到的淀粉样老年斑，实则是这些「毒花」神经元死亡后的「遗骸」！
总结来看，这项研究首次发现，在AD病理中，神经元内自噬障碍先于Aβ沉积，是上游事件，而非传统意义上的下游事件。
疾病早期，Aβ就在存在自噬障碍的神经元内沉积；自噬障碍进一步触发了应激事件，消化不良的自噬溶酶体在神经元内围绕核周形成绮丽的「毒花」，并在胶质细胞和溶酶体碱化的推动着下，导致神经元死亡，「死亡残骸」就是老年斑。
整个这一过程极大颠覆了以往我们对老年斑形成过程的认知。
值得一提的是，研究团队发现，通过修复PSEN1相关的溶酶体酸性缺陷可以改善AD模型中的自噬障碍和其他与AD相关的病理。
最后再问一个细思恐极的问题。我们知道，在痴呆出现前的10~20年里，Aβ就开始沉积。现在我们又知道，自噬的酸化障碍要早于Aβ的沉积，那么AD的种子究竟是何时埋下的？
参考文献：
[1]https://www.nia.nih.gov/news/nia-statement-crenezumab-trial-results-anti-amyloid-drug-did-not-demonstrate-statistically
[2]Lee, JH., Yang, DS., Goulbourne, C.N. et al. Faulty autolysosome acidification in Alzheimer’s disease mouse models induces autophagic build-up of Aβ in neurons, yielding senile plaques. Nat Neurosci 25, 688–701 (2022).
本文作者丨candy
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