截至2020年5月12日，新型冠状病毒肺炎（COVID-19）已造成4,274,012例感染，287,755例死亡，且感染和死亡人数还在持续增长。新型冠状病毒（SARS-CoV-2）具有潜伏期长、传染性强、传播迅速且人群易感性强等特点[1]。在感染初期，患者主要表现为发热、干咳，另有少部分患者表现出缺氧、低氧和呼吸困难等症状[2]，严重患者会出现脓毒症休克等危及生命的症状[3]。然而，临床目前尚无特效治疗药物。因此，相比于治疗，控制SARS-CoV-2传播和预防SARS-CoV-2感染也是防治工作中的重点。 中医药在此次抗疫中发挥了非常重要的作用[4]。湖南省多位国医大师和专家经过反复分析论证开出了湖南一号方和湖南二号方。其中湖南一号方主要针对成年人，而湖南二号方主要针对老年人和儿童。主要是因为老年人免疫力下降[5]，而儿童免疫系统还未完全发育[6]。因此，老年人、儿童及体虚者成为了防治SARS-CoV-2感染的重点关注人群。湖南二号方由黄芪30 g、陈皮9 g、山银花15 g、大枣5枚和甘草7 g组成。其中，黄芪甘温，大补脾肺之气，固表实卫，重用为君药；陈皮辛苦性温，理气健脾，和中燥湿，合黄芪既能助其健脾之功，又使其补而不滞，为臣药；山银花辛凉，既有辛凉透邪、清热解毒之效，又有芳香辟秽之功，为佐药；大枣、甘草益气健脾，合黄芪加强益气实卫固表之功，甘草兼能调和诸药，共为佐使。诸药配伍，重在培固正气，兼以辟秽化湿，清解热毒，能够全面提升人体免疫功能。综上，通过中医药干预提高人体免疫力对于COVID-19的防治具有积极的意义。 网络药理学是探究中药复方作用机制的有效方法。本研究基于系统生物学理论和机体的免疫调节功能，应用网络药理学从细胞分子层面探究湖南二号方防治COVID-19的作用机制，为安全用药提供了理论依据。通过收集湖南二号方中活性成分、疾病相关的靶点，构建中药-成分-靶点-疾病网络。预测湖南二号方与COVID-19之间的关系，探究湖南二号方防治COVID-19的作用机制，为该药更广泛地应用于临床防治COVID-19提供理论依据。 方 法 依据药代动力学ADMT参数，通过TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、TCM Database@Taiwan（）http://tcm.cmu.edu.tw/)和TCMID（http://www.megabionet.org/tcmid/）等数据库分别以黄芪、陈皮、山银花、大枣、甘草为关键词进行检索。以口服生物利用度（OB）≥30%且化合物类药性（DL）≥0.18为条件[7-8]，筛选湖南二号方中的有效成分。将PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库得到的效活性成分三维结构导入PharmMapper（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）和Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）数据库中进行有效活性成分靶点预测；以“COVID-19”“Immunity”“Pneumonia”为关键词通过NCBI Gene（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、OMIM（https://omim.org/）、GeneCards（https://www.genecards.org/）等疾病靶点数据库进行检索，获取COVID-19、免疫和肺炎相关的疾病靶点。将活性成分靶点与疾病靶点相互映射，得到共有靶点。 通过STRING（https://STRING-db.org）数据库对共有靶点进行蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI）分析。通过Cytoscape3.8.0计算得到该网络中每个靶点Degree值，进而分析得到湖南二号方防治COVID-19的核心靶点。利用活性成分、疾病靶点及PPI网络中的信息，通过Cytoscape3.8.0构建得到中药-成分-靶点-疾病网络模型。 通过DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）数据库对共有靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析。旨在通过细胞层面和分子层面明确湖南二号方防治COVID-19在细胞内发生反应的位置、涉及的分子功能和生物学过程，从信号通路层面探究湖南二号方防治COVID-19，提高免疫的分子机制。 结 果 通过TCMSP、TCM Database@Taiwan和TCMID等数据库检索湖南二号方，获取湖南二号方中OB≥30%且DL≥0.18的活性成分（见图1），其中有8种成分为5种中药的共有成分（见表1）。根据活性成分进行靶点预测（见图2），删除冗杂，得到湖南二号方99个活性成分及236个相关靶点。通过NCBI Gene、GeneCards、DisGeNet、TTD、OMIM、Drug Bank database等数据库获取疾病相关的靶点，其中COVID-19为11个，肺炎为232个、免疫相关靶点为10,221个。删除冗杂，得到疾病相关基因8859个。
图1 湖南二号方活性成分
图2 湖南二号方单味中药靶点
通过构建韦恩图预测湖南二号方防治COVID-19的共有靶点（见图3），相关信息见表2。
图3 湖南二号方共有靶点韦恩图
将共有靶点导入STRING数据库，构建PPI网络并寻找核心靶点。设置Score值为0.400，得到PPI网络。将该网络导入Cytoscape3.8.0软件进行可视化（见图4），并分析得到30个核心基因。（见图5）
图4 湖南二号方共有靶点的相互作用网络可视化
图5 湖南二号方共有靶点的核心基因
通过Cytoscape3.8.0软件进行网络分析构建。以分子（Molecule）的首字母M加序号表示活性成分的简写。该网络中包含5味中药、99个活性成分、73个靶点和958条边，其中红色为共有靶点，深蓝色为多味中药的共有成分。（见图6）
图6 湖南二号方中药-成分-靶点-疾病网络
共有靶点的GO功能富集分析涉及1962个GO功能条目（P＜0.05），生物过程（biological process）涉及对脂多糖的应答等1833条相关条目；细胞组成（cellular component）涉及膜筏等31条相关条目；分子功能（molecular function）涉及细胞因子活性等97条相关条目。（见图7～9）
图7 湖南二号方共有靶点的生物过程富集分析
图8 湖南二号方共有靶点的细胞组成富集分析
图9 湖南二号方共有靶点的分子功能富集分析
共有靶点的KEGG通路富集分析涉及145条通路（P＜0.05）。主要代谢通路根据P-value由小到大的顺序排列，主要涉及AGE-RAGE、TNF、IL-17、HIF-1和PI3K-Akt等多条信号通路。（见图10）
图10 湖南二号方防治COVID-19涉及基因的KEGG富集分析
讨 论
免疫力低下的老年人、儿童和体虚者成为了此次疫情中处境最危险的群体，大规模无症状感染者的出现，也使得防治难度加大。然而，目前却无任何特效药。此外，先天免疫是抵抗病毒、微生物等感染及多种炎症性疾病的第一道防线，且先天免疫和获得性免疫在消除外源性感染方面具有协同作用[9-10]。因而，增强免疫功能、提高机体抵抗力成为了防治工作的重点内容。而本研究基于网络药理学方法，通过构建中药-成分-靶点-疾病网络和PPI网络，分析表明其药理活性与AGE-RAGE、HIF-1、TNF、IL-17、PI3K-Akt、Toll样受体、T细胞受体等调控机体免疫通路密切相关，提示其可能通过IL-6、VEGFA、ALB、CXCL8、MMP9、AKT1等靶点增强机体免疫功能发挥抗SARS-CoV-2感染的作用。
湖南二号方中的β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇、柑橘碱、木犀草素、异鼠李素、槲皮素、儿茶素、柚皮素等活性化合物可能主要通过调节免疫、炎症和抗病毒感染等信号通路治疗COVID-19。其中槲皮素能够阻断流感病毒（H1N1、H3N2）进入细胞内，并通过与流感病毒的血凝素蛋白相结合，抑制病毒引起的溶血反应[11]。最新研究表明，SARS-CoV-2会引起独特的免疫应答，即感染患者表现出Ⅰ/Ⅲ型干扰素极低水平，而CXCL1、CXCL2和CXCL8等趋化因子和IL-6高表达，提示感染机体免疫功能削弱的同时促进炎症应答。这种紊乱的免疫反应会导致免疫力低下的老年患者早期对病毒的抑制更弱，而健康成年人则更易出现无症状感染[12]。例如，在COVID-19的快速发展阶段，初期的免疫应答和炎症反应会诱导严重的细胞因子风暴。由先天免疫细胞分泌的IL-17能够激活NF-κB等下游途径，诱导细胞因子的表达，并且病毒性感染通过影响IL-17的信号传导激活STAT3，从而导致肺部炎症[13-15]。因此，通过增强机体免疫功能进行抗病毒防治是基础。本研究发现湖南二号方中木犀草素、山奈酚和槲皮素等可通过抑制IL-17、TNF、VEGF、HIF、P35和PI3K-Akt等炎症信号通路中的IL-6、IL-1B、IL-4、PTGS2、CASP3、BCL2L1、STAT3、CXCL8、CCL2等炎性细胞因子和趋化因子的表达[11,16-17]，抑制相关的氧化应激与炎症风暴，进而提高人体免疫力[18-19]。研究发现，10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）不仅能够增强干扰素应答，还在抗病毒先天免疫中发挥着至关重要作用[20]。PI3K-Akt途径的去磷酸化可通过激活PTEN，调节Ⅰ型干扰素反应和抗病毒的先天免疫[10]。研究进一步证明Ⅰ型干扰素能有效抑制SARS-CoV-2的感染[21]。此外，SARS-CoV-2引起的独特免疫应答会导致患者的干扰素降低，湖南二号方可能通过激活PI3K-Akt通路的去磷酸化增强干扰素反应，预防病毒入侵。COVID-19患者的临床报告显示，并发糖尿病或高血糖的患者住院死亡率为29%，而没有这些症状的患者的住院死亡率仅为6%。这是由于糖尿病患者T细胞和巨噬细胞增殖发生改变，NK细胞和B细胞功能受损，导致先天和适应性免疫异常。因此，糖尿病患者对病毒的易感性增加[22-23]。COVID-19导致的急性呼吸窘迫综合征（ARDS）也与糖尿病发生密切相关[24]。湖南二号方中的儿茶素可通过抑制糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路和NF-κB信号通路中STAT3、CASP3、VEGFA、MAPK3、NOS3等靶点，对并发糖尿病的患者发挥较好的治疗作用[25]，增强糖尿病老年患者的免疫力。更重要的是，COVID-19患者会出现低氧和缺氧的状态，同时，低氧还会诱导炎症细胞浸润和细胞因子释放等炎症反应，不仅会导致组织缺血、心肌损伤和凋亡，也会影响既往动脉粥样硬化心血管疾病患者的斑块稳定性。HIF-1通路中缺氧诱导因子1α（HIF-1α）是介导先天免疫关键的调节剂，Toll样受体通路中Toll样受体3（TLR3）的信号转导能够显著上调HIF-1α，而HIF-1α通过糖酵解开关方面的既定作用来调节先天免疫介导的重编程，增强免疫力[26]。湖南二号方通过同时调节HIF-1和Toll样受体两条关键信号通路，促进HIF-1α的表达水平升高，增强免疫力低下者对SARS-CoV-2的抵抗力。此外，湖南二号方筛选的JAK-STAT、T细胞受体、TNF等其他信号通路能够通过介导的非典型干扰素样反应，进而有效地抑制病毒在人体的复制[27-29]。SARS-CoV-2感染还会继发肺纤维化[30]，研究发现，通过抑制MAPK的磷酸化和NF-κB的信号转导可以预防肺纤维化[31]，柑橘碱、柚皮素可通过抑制MAPK和NF-κB信号通路来预防SARS-CoV-2引起的肺纤维化和减轻支气管的炎性细胞浸润[32-33]。而槲皮素不仅可以抑制TNF信号通路中IL-6、IL-1B、CXCL10、PTGS2等炎症细胞因子和趋化因子，而且还能抑制SphK1/S1P信号传导减轻肺纤维化[34-35]。因此，湖南二号方的多种活性成分可通过调节多条信号通路调节机体免疫功能和减弱SARS-CoV-2引发的一系列并发症和后遗症，不仅能对COVID-19患者起到治疗作用，还能对健康人群起到预防作用。
综上，本研究基于增强机体免疫功能，采用网络药理学对湖南二号方防治COVID-19感染的作用机制进行分析，旨在为老年人、儿童和免疫力低下者使用中医药方法防治COVID-19感染提供理论依据。
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