我们的研究结果表明，在 α-突触核蛋白病帕金森病和多系统萎缩中，少突胶质细胞中存在早期细胞通路和网络改变。他们进一步揭示了由α-突触核蛋白触发的免疫成分的参与，以及多系统萎缩中（表观）遗传变化与免疫反应性之间的联系。本研究中产生的知识可用于设计治疗突触核蛋白病的新治疗方法。
有限的证据揭示了 aSYN 蛋白如何影响突触核蛋白病的少突胶质细胞表型和发病机制，包括帕金森病 (PD) 和多系统萎缩 (MSA)。在这里，我们研究了由患者诱导的多能干细胞 (iPSC) 产生的PD 和 MSA O4 +少突胶质细胞谱系细胞 (OLC) 内的早期转录组变化。我们发现与对照相比，PD 和 MSA O4 + OLC 的成熟受损。这种表型与人类白细胞抗原 (HLA) 基因、免疫蛋白酶体亚基 PSMB9 和 aSYN p.A53T 和 MSA O4 + OLC 的补体成分 C4b 的变化有关，但与SNCA行程O4 +无关尽管 aSYN 组装形成水平很高，但 OLC。此外，SNCA过表达导致 O4 + OLC 的发展，而用 aSYN 物种的外源处理导致显着毒性。值得注意的是，编码形成路易体和神经胶质细胞质内含物的蛋白质的基因的转录组分析揭示了 PD aSYN p.A53T O4 + OLC与 MSA O4 + OLC 的聚集。我们的工作确定了人类 PD 和 MSA O4 + OLC 中的早期表型和致病变化。
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突触核蛋白病是一组神经退行性疾病，其典型特征是在帕金森病 (PD) 和路易体痴呆 (DLB) 的神经元中存在称为路易体 (LBs) 的富含 α-突触核蛋白 (aSYN) 蛋白的聚集体。或者，少突胶质细胞内的 aSYN 阳性胶质细胞质内含物 (GCI) 是多系统萎缩 (MSA) 的独特特征 ( 1 )。然而，最近的病例报告显示，在携带LRRK2 (p.I1371V)、SNCA (p.G51D 和 p.A53E) 和DJ1遗传变异的 PD 患者死后大脑中，少突胶质细胞和/或星形胶质细胞中存在 GCI 样结构(p.L172Q) 基因 ( 2 – 5）。有趣的是，尽管磷酸化的 aSYN 水平很高，但在携带 aSYN 变异 p.H50Q 或SNCA基因座重复的 PD 脑中的少突胶质细胞中无法鉴定到内含物( 2 )。这些数据表明家族性 PD 病例之间存在病理差异。然而，在某些形式的 PD 而不是其他形式的 PD 中形成 aSYN 阳性 GCI 样结构的原因仍然未知。
我们和其他人之前已经表明，啮齿动物和人类少突胶质细胞谱系细胞 (OLC) 在发育过程中表现出不同水平的 aSYN ( 6 – 8 )。有趣的是，在 MSA 脑中的 OLC 中发现编码 aSYN的SNCA基因的表达增加（ 9）。此外，OLCs 已被证明在体外吸收不同的 aSYN 组件 ( 10 – 12 )。因此，识别由SNCA导致的致病性 aSYN 的存在引起的变化与能够诱导从头聚集的 aSYN 组件的摄取相结合的表达可以允许识别可以被调节以治疗突触核蛋白病的治疗途径。通过对患者诱导的多能干细胞 (iPSC) 衍生的 O4 + OLCs 进行转录组学分析，我们确定了诱导 OLCs 采用抗原呈递表型的信号通路，从而阻碍其成熟为有髓鞘的少突胶质细胞。我们进一步证明，抗原呈递表型可以由纤维状 aSYN 变体通过激活炎症途径触发，包括激活 PD (p.A53T aSYN) 和 MSA OLC 中的免疫蛋白体。
为了研究人类少突胶质细胞是否在 PD 中表现出细胞改变，我们使用了对照（13、14）和 PD 衍生的 iPSC 系，这些 iPSC 系含有杂合 aSYN 变异 p.A53T（15 ）（SI 附录，图 S1）。家族性 aSYN p.A53T 导致早期 PD 发作 ( 16 ) 和 iPSC 衍生的 aSYN p.A53T 神经元中强大的细胞病理学 ( 17 )。在这项研究中，我们使用我们发布的协议 ( 6、18 )从aSYN p.A53T iPSC 生成 OLC 。自由浮动的 100 天球体表达 OLC 规范标记 SOX10、OLIG2 和 NKX2.2（SI 附录，图 S2) 但大多缺乏 O4，这是髓鞘前少突胶质细胞阶段的标志物。为了刺激少突胶质前体细胞 (OPCs) 成熟为 O4 + OLC，我们将球体接种到涂层表面上，然后确认 OLC 自然表达SNCA基因[图 1 A和B ( 6 )]。我们接下来使用 Affymetrix GeneChip 微阵列检查荧光激活细胞分选仪 (FACS) 纯化的 O4 + OLC 中的转录组变化（SI 附录，图 S3和数据集 S1）。Pearson 的相关性揭示了样本、分类对照和 aSYN p.A53T O4 +之间的分离单独的OLC（图1 C）。在分析的 135,750 个探针中，我们确定了 1,494 个注释基因显着上调或下调（图1D），至少有两倍的变化。编码参与少突胶质细胞分化和成熟的蛋白质的 50 个最显着下调的基因中有 33 个，而编码 MHC I 类和 II 类蛋白质的人类白细胞抗原 (HLA) 基因高度上调（图 1 E） . 具有超几何分布的基因本体（GO）注释富集表明细胞成分和生物过程术语的显着富集（图1 F）。细胞成分术语包括细胞-基质连接和早期内体，而生物过程术语包括神经系统发育的胶质发生和负调节。
图。1。
为了进一步了解遗传和细胞变化，我们进行了基因集富集分析 (GSEA) ( 19 )。我们确定了几种途径的阳性和阴性基因富集，包括免疫系统（抗原加工和呈递）和少突胶质细胞分化和成熟（脂质代谢；图1G）。重要的是，由于对 aSYN p.A53T 转录组和含有 TH + /FOXA2 +神经元的对照 iPSC 衍生的中脑球体的转录组分析揭示了不同类别的改变，包括由六个基因定义的儿茶酚胺代谢过程，因此转录组变化对少突胶质细胞具有特异性，即DDC、AGTR2、TH、EPAS1、NR4A2（称为NURR1）和DBH（SI 附录，图 S4和数据集 S2）。
接下来，我们通过 Cytoscape ( 20 )使用 Stringdb来识别基因之间的相互关系，这些基因显着上调或下调至少两倍。连接了几个基因，尤其是那些编码子网络 MAG-CNPase-MBP-MOG-PLP1-MOBP-CLDN11（图 1 H）的基因，这些基因是髓磷脂蛋白质组的组成部分（21）。我们还发现肽精氨酸脱亚胺酶 II 型的表达降低，这是少突胶质细胞分化和髓鞘形成所需的一种酶 ( 22 )。调节信使 RNA 翻译成蛋白质的 MicroRNAs 也发生了改变（数据集 S1）。其中，我们鉴定了与少突胶质细胞分化和成熟相关的 microRNA (miR)-9、miR-138 和 miR-219 ( 23 )。还确定了脂质相关基因表达的显着变化（数据集 S4）。这些数据表明aSYN p.A53T少突胶质细胞的终末分化受损。事实上，使用荧光图像分析，我们发现与对照相比，aSYN p.A53T 培养物中的 O4 + OLCs 数量较多，但 MBP +成熟少突胶质细胞数量较少 ( 24 , 25 )（图 1 I和J）。通过蛋白质印迹分析证实了这些数据（图 1 K）。我们的分析进一步揭示了与对照组相比，在体外老化 100 天 (DIV) 的自由浮动 aSYN p.A53T 球体培养物中 OPC 标记物 PDGFRα ( 24 , 25 ) 的水平增加（图 1 K和SI 附录、表 S1和数据集 S1 )。为了验证这些发现，我们将 OLC 与野生型 (WT) 产生的小鼠胚胎干细胞和 PD 的 M83 小鼠模型区分开来，后者在朊病毒启动子下表达人 aSYN p.A53T 转基因 ( 18 , 26 , 27 )。根据我们的人类 OLC 数据，我们观察到较少数量的 CNPase +OLC 与对照相比，表明终末分化受 aSYN p.A53T 的影响（SI 附录，图 S5）。最后，人类 OLC 的流式细胞术分析显示，与对照相比，aSYN p.A53T 培养物中双阳性 O4 + /HLA-F +和 O4 + /HLA-DR/DQ/DP + OLC 的数量增加了 ~1.5 倍（图 1 I），结果与我们的基因表达谱一致。
总之，我们的数据表明人类 O4 + aSYN p.A53T OLC 增加了 HLA 基因的表达，并且可能延迟了成熟，因为 OLC 能够在 M83 PD 模型中形成轴突 ( 28 – 30 )。我们的数据进一步表明，在发育过程中，O4 + aSYN p.A53T OLC 可能表现出免疫反应表型，类似于在多发性硬化症中观察到的表型 ( 31 )。
我们接下来检查了转录组变化是否也出现在由携带SNCA基因座三倍的个体（称为SNCA trip）和两名 MSA 患者（一名被诊断为进行性共济失调而另一名具有主要的 PD 样症状）产生的 O4 + OLC 中。因此，我们使用来自 PD（ SNCA行程：CSC-3G、CSC-3S 和 CSC-28N）（6、14、32 ）和MSA（MSA-C：CSC-30B、CSC）的几种疾病特异性 iPSC 系生成OLC -30C 和 CSC-30D；和 MSA-P：CSC34D、CSC-34F 和 CSC-34M；SI 附录，图 S1）。我们发现了源自SNCA trip（830 个基因）、MSA-C（1,604 个基因）和 MSA-P（2,032 个基因）的 FACS 纯化的 O4 + OLC中许多基因表达的显着变化（图 2 A和B和SI 附录，图 S3和数据集 S6 和 S7）。有趣的是，与 aSYN p.A53T O4 + OLCs 相似，编码 MHC 类分子的基因在 MSA-C 和 MSA-P O4 + OLCs 中显着上调，但在SNCA trip O4 + OLCs 中没有（图 2 C）。然而，编码参与少突胶质细胞分化和成熟的蛋白质的基因在所有基因型中都被下调（图 2 C和SI 附录，表 S1和数据集 S4 和 S5）。这些发现与 GSEA 数据一致，该数据揭示了 MSA-C 和 MSA-PO4 + OLC 内抗原呈递和加工的阳性富集，但所有三种基因型中脂质代谢的阴性富集（图2D）。
图 2。
SNCA trip O4 + OLCs显着丰富的 GO 术语包括信号识别粒子依赖性共翻译蛋白靶向膜，MSA-C：细胞内蛋白质转运和蛋白质靶向，以及 MSA-P：肽生物合成过程和翻译（图 2 E )。与 aSYN p.A53T O4 + OLCs 类似，我们在SNCA行程、MSA-C 和 MSA-P O4 + OLCs中观察到高水平的 PDGFRα 和低水平的 MBP （图 2 F）。我们还确认了双阳性 O4 + /HLA-F +和 O4 + /HLA-DR/DQ/DP百分比的变化+ SNCA行程中的OLC以及 MSA 培养（图 2 G）。总体而言，MSA-C 和 MSA-P O4 + OLC 中发现的变化与 aSYN p.A53T O4 + OLC 中发现的变化比SNCA trip O4 + OLC 中发现的变化更相似。这表明 PD aSYN p.A53T OLC病理在疾病严重程度、发病和进展方面可被视为 PD SNCA行程和 MSA OLC 病理之间的中间体 ( 33 , 34 )。
因为所研究的基因型与 aSYN 病理学有关，我们检查了从突触核蛋白病与对照培养物中富集的附着或球形 OLC 中的 aSYN 水平。aSYN p.A53T OLC 培养物中 aSYN 的免疫印迹分析显示，在 100 和 130 DIV 时单体 aSYN (14 kDa) 水平较低，但高分子量 (MW) aSYN 水平较高（图 3A ，左）。对于SNCA trip OLC 附着或球状培养物，我们观察到单体和高分子量 aSYN 分别在 100 和 130 DIV 时增加（图3A ，中间）。对于 MSA-C 和 MSA-P 培养物，我们观察到自由浮动球体和附着的 OLC 培养物中的高分子量 aSYN 物种显着增加（图 3A，右）。有趣的是，我们还观察到 100 个 DIV 球体中丝氨酸 129 处 aSYN 磷酸化的显着变化（SI 附录，图 S6）。此外，我们发现在SNCA trip、MSA-C 和 MSA-P 中总 aSYN 水平发生了变化，但在 aSYN p.A53T 球体或附着的 OLC 培养物中没有变化（图3A）。傅里叶变换红外 (FTIR) 分析进一步揭示了 β-折叠结构含量的增加，这让人联想到 FACS 纯化的 O4 + OLC中的蛋白质聚集。图 3 B )。有趣的是，aSYN 也存在于培养基中，但其水平与细胞死亡无关（SI 附录，图 S7）。总之，这些数据表明 1) aSYN 可能由于其内源性表达和/或从培养基中摄取而诱导细胞功能障碍，2) OLC 中存在的 aSYN 物种的结构和性质可能因所研究的不同基因型而异，以及3）在 MSA OLC 中观察到的 aSYN 水平的变化可能与潜在的（表观）遗传病理过程有关。
图 3。
为了检查在上述 PD 和 MSA O4 + OLC 中发现的转录组变化（即少突胶质细胞分化基因的下调和/或 HLA 基因的上调）是否由内源性表达或摄取 aSYN 触发，我们要么过表达 WT，要么p.A53T aSYN 在 OLC 中或将它们暴露于单体或纤维组件（WT 或 p.A53T aSYN）。我们采用基于逆转录病毒载体的方法来过度表达 aSYN 转基因，以分裂 110 至 115 DIV 的对照培养物中存在的 iPSC 衍生的神经祖细胞和 OPC；这使我们能够仅捕获未成熟 OLC 中由 aSYN 引起的变化。病毒构建体包含绿色荧光蛋白 (GFP) 报告基因，而外源 aSYN 组件与 ATTO-488 偶联，从而能够纯化 O4 +/GFP +和 O4 + /ATTO488 + FACS 的 OLC（图 3 D - F和SI 附录，图 S8 和 S9）。转录组分析（数据集 S6 和 S7）显示，用 aSYN p.A53T 原纤维处理 O4 + OLC 导致CLDN11、MOBP和MBP基因（髓鞘形成的常见标志物）的表达降低；这在 WT 原纤维中没有观察到（图 3 G和H）。相比之下，WT 和 p.A53T aSYN 过表达引发 NKX2.2 表达的显着增加、CNPase、MYRF、MAG、MBP和MAPT基因，在少突胶质细胞分化过程中表达的标志物（图 3 G和I），但与 OLC 数量的增加无关（图 3 J）。虽然 WT 和 p.A53T aSYN 的过表达引发HLA-DQb1基因表达的低增加，但用 aSYN 物种处理主要增加了 HLA 基因的表达，特别是HLA-L（图3K）。然而，HLA 基因的上调不如源自 PD p.A53T aSYN 或 MSA iPSC 衍生的 O4 +的那些强OLC，可能是由于持续的细胞毒性。事实上，我们观察到由 aSYN 单体诱导的O4 + OLC 的细胞死亡，这在 aSYN 原纤维中更为明显（图 3 K和L）。总而言之，这些数据可能表明 aSYN 在 OLC 分化过程中很重要，并且随着时间的推移在其中构建或被它们吸收的 aSYN 组装可能是导致 OLC 的免疫反应表型的原因。
接下来，我们检查了 O4 + OLC内的转录组变化是否可以提供对死后 PD 和 MSA 大脑中发现的病理特征的洞察。我们采用有针对性的方法来识别编码组成 GCI 和 LB 的蛋白质的基因表达的变化。我们推断，如果存在早期细胞变化，它们将反映在少突胶质细胞发病机制早期参与的途径中。这个理由是基于这样一个事实，即在研究的基因型中（图 4 A和数据集 S8 ），O4 +中的一些基因表达变化OLC 是共享的，但其他的则不是，这表明常见的和基因型特异性的改变。因此，我们检测了之前在 GCI 和 LB 中发现的 99 个编码蛋白质的基因的表达 ( 35 – 46 )。我们基于 Reactome 数据库将基因分类为相互关联的途径（图 4 B）。值得注意的是，99个靶向基因的最大富集功能基因类别与免疫反应有关（图4C）。有趣的是，PD aSYN p.A53T O4 + OLCs表现出几个基因的表达变化，这些变化与那些在 MSA-C 和 MSA-P O4 + OLCs 中表达改变的基因非常相似，导致与 MSA-C 和 MSA-P 的聚类O4 +OLC，但不是 PD SNCA跳闸OLC（图 4 D和数据集 S8）。PSMB9表达在 PD aSYN p.A53T O4 + OLC 中显着增加，表明免疫蛋白酶体的参与（参考文献47；图4D）。还观察到参与溶解免疫聚集体和蛋白质抗原 ( 48 , 49 ) 的C4a和C4b基因表达增加（数据集 S9）。我们通过免疫细胞化学和蛋白质印迹分析进一步证实了在突触核蛋白病和 aSYN 组装处理的培养物中 PSMB9 和 C4b 蛋白水平的增加（图 4 E - G）。
图 4。
为了验证我们的结果，我们对 PD 和 MSA 死后脑区进行了蛋白质印迹分析（SI 附录，表 S2）。我们发现与对照组相比，MSA 大脑的小脑和基底节以及 PD 病例的黑质内 PSMB9 水平升高的趋势（图4H）。然而，C4b 的水平因所分析的大脑区域而异。与对照组相比，MSA 患者小脑中的 C4b 水平较低，而 PD 和 MSA 样本的黑质和皮质下白质中的 C4b 水平较高。这些差异可能反映了疾病末期患者的异质性和区域特异性神经病理学差异（50)，这可能与患者 iPSC 衍生的 OLC 中发现的早期细胞发病机制相关或有所不同。重要的是，使用免疫组织化学技术，我们发现与对照相比，MSA 和 PD 中的 PSMB9 水平更高，不仅在 OLIG2 +和 GCI +细胞中，而且在 MAP2 +和 GFAP +细胞类型中（数据集 S9）。总之，我们的数据表明，这些疾病具有很强的免疫成分，在疾病过程的早期出现并持续到疾病的末期（图 4 I和J）。
最近才描述了 PD 和 MSA 死后大脑中 OLC 转录组的变化 ( 51 , 52 )。在这里，我们提供了早期 OLC 病理学和/或 PD 和 MSA 功能变化的证据。然而，由于在 OLC 成熟期间SNCA表达的自然降低，这些表型可能不会出现在所有 PD 患者中( 6 )。尽管如此，它们提供了有关 MSA 中可能发生的早期细胞功能障碍的信息，其中SNCA表达高于健康大脑 ( 9 )，或在 PD 形式中，其中在尸检后在 OLC 中发现 GCI 样结构( 2-5）。重要且出乎意料的是，我们的工作表明（表观）遗传变化与 MSA 中的免疫反应性之间存在联系。
我们的研究中出现的第一个主要观察结果是，来自 PD 和 MSA 患者的 iPSC 衍生的 O4 + OLC 的成熟显着受损。PD和MSA中与OLC分化和髓鞘形成相关的基因转录和MBP蛋白水平显着降低。因为过表达转基因人 aSYN p.A53T 的小鼠具有髓鞘轴突 ( 27 )，我们推测 PD 和 MSA iPSC 衍生的 OLC 成熟受损是由于延迟而不是阻碍成为有髓鞘的 OLC。另一种解释可能是在 PD 和 MSA 中产生了更多的免疫反应性 OLC，因此改变了在发育过程中产生的 OLC 亚型的比例（53 - 55）。事实上，人们可以推测，在疾病状态下，免疫性 OLC 的比例会增加，这是因为功能发生了变化而变得免疫反应，这是一种有效的反应，例如，针对 aSYN 组装的早期积累。我们的数据还表明胆固醇、半乳糖神经酰胺和乙醇胺纤溶酶原脂质对髓鞘形成很重要（56）。最近描述了 PD 脑细胞类型中脂质组成的变化 ( 57 )，目前正在研究 PD GBA基因变异体中脂质之间在 aSYN 聚集过程中的相互作用 ( 58 )。
WT 和 p.A53T SNCA转基因在分裂神经祖细胞和 OPCs 中的过表达诱导少突胶质细胞基因NKX2.2、CNPase、MAG、MOG和MBP的表达，同时下调早期腹侧前脑谱系基因DLX5和星形胶质细胞基因GFAP和FACS 纯化的 GFP + /O4 + OLC 中的CD44。有趣的是，PDGFRα + OPCs 成熟为 MBP +少突胶质细胞以前被证明是延迟的，并且在成熟少突胶质细胞中过表达SNCA后报告了脱髓鞘 ( 29 , 30）。这些数据表明，SNCA表达是神经祖细胞向少突胶质细胞谱系或 OPC 成熟为 O4 + OLC 所必需的，而SNCA下调是 OLC 进一步成熟为富含髓鞘脂质的少突胶质细胞所必需的。正如最近提出的，SNCA在疾病中的异常重新表达可能引发髓鞘形成缺陷 ( 59 )。此外，我们发现所研究基因型中单体和高分子量 aSYN 水平的变化。此外，p.A53T aSYN 原纤维导致晚期少突胶质细胞分化基因的下调。以前的工作表明，天然存在的高分子量 aSYN 物种具有生理作用（60) 和SNCA的靶向诱变可防止小鼠中易聚集的单体形成 ( 61 , 62 )。我们推测这可能适用于少突胶质细胞的命运和成熟。少突胶质细胞谱系规范可能需要增加水平的高分子量或单体 aSYN，而低水平的高分子量 aSYN 或单体可能是 OPC 成熟和维持为 MBP +少突胶质细胞所必需的。因此，少突胶质细胞中的高 aSYN 水平可能会延迟成熟或改变其功能以成为抗原呈递细胞；由于 p.A53T aSYN 的遗传变异和蛋白质的构象变化，p.A53T aSYN 的存在可能具有类似的效果 ( 63 , 64）。我们发现患病的 OLC 的成熟度受损，这与数据表明在 PD 中存在与认知能力下降相关的广泛的脑白质 ( 65 ) 病理学 ( 66 )。这些发现也很有趣，因为 Windrem 及其同事 ( 67 ) 表明，由精神分裂症患者产生的 iPSC 衍生的神经胶质表现出与延迟成熟相关的细胞自主病理学。
本研究的第二个主要观察结果是先天性炎症成分的参与，通过 PD p.A53T aSYN 和 MSA O4 + OLC 中补体成分 C4b、HLA 和免疫蛋白酶体亚基基因的表达增加来揭示。Kirby 及其同事最近的一项研究 ( 31 ) 表明，在多发性硬化症的实验模型中，少突胶质细胞变得免疫反应，而不是成熟为有髓鞘的少突胶质细胞。我们的数据表明这也适用于 MSA 和 PD p.A53T aSYN iPSC 衍生的 O4 +OLC 可能是由于高分子量 aSYN 的结构和性质以及 p.A53T 变异所致。与从 PD 和 MSA 大脑中获得的相比，在受控条件下体外产生的 aSYN 原纤维之间存在重大差异，正如播种活动和低温电子显微镜所揭示的那样 ( 68 – 72 )。事实上，Peng 及其同事 ( 70 ) 发现 GCI 衍生的 aSYN 种子在从头聚合后比 LB 衍生的种子效力高 1,000 倍。此外，与 PD 患者脑提取物相比，MSA 患者脑提取物在工程人类胚胎肾细胞系和家族性 PD 小鼠模型（过表达 pA53T aSYN 的 M83 小鼠）中极大地引发了 aSYN 聚集 ( 71 )。这可以解释为什么 O4+ MSA-C 和 MSA-P 中的 OLC 发病机制比SNCA行程O4 + OLC 或用人 WT aSYN 原纤维处理对照 O4 + OLC 后更明显。
在 MSA 病理学（MSA-P 和 MSA-C）和 PD SNCA trip中，蛋白质聚集体包含 WT aSYN，而在携带杂合遗传变异 p.A53T aSYN 的患者中，突变体 aSYN 也包含在聚集体中。因此，令人惊讶的是，p.A53T aSYN O4 + OLCs 内的基因表达变化与 MSA O4 + OLCs 内的基因表达变化比SNCA trip O4 + OLCs 内的基因表达变化更相似。基因表达分析进一步表明，aSYN p.A53T O4 + OLC遵循的转录组模式更类似于 MSA-P 和 MSA-C O4 + OLC，而不是SNCA trip O4+ OLC，尽管 aSYN p.A53T 和SNCA行程都导致 PD。基于之前的工作 ( 70 , 71 , 73 )，我们推测 p.A53T aSYN 组件的结构特性、播种倾向和致病性比 aSYN SNCA trip更接近 MSA 组件，并且这些特征是由细胞自主变化引起的。 p.A53T aSYN 和 MSA 基因型比 PD SNCA trip基因型更接近（基于我们的基因表达数据）。因此，PD aSYN p.A53T OLC 病理严重程度、疾病发作和进展可以被认为是 PD SNCA行程之间的中间体和 MSA 病理学。
值得一提的是，MSA 更致命，并且该疾病具有比特发性 PD 更严重的表型。由于疾病特异性细胞内环境中的转录后蛋白质修饰可能导致蛋白质原纤维的结构异质性 ( 74 ) 并可能使它们或多或少有害和/或易于聚集，因此未来的努力应致力于解开 aSYN 的结构和特性不同突触核蛋白病患者不同脑区和细胞类型的纤维状多态性（SNCA ）变异、特发性 PD、DLB、MSA-P、MSA-C、非典型 PD 等）。这将允许通过进行大规模表征和并排朊病毒样播种实验或冷冻电镜来定义这些聚集体的致病性。这样的工作可以帮助阐明突触核蛋白病患者中 aSYN 的聚集状态。揭示致病性原纤维多晶型物的结构对于 1) 开发个性化治疗非常重要，例如，通过患者特异性抗 aSYN 抗体，这些抗体不会干扰单体和非致病性 aSYN 寡聚体的自然功能，但可以刺激早期免疫反应中和致病物种，从而防止对 OLC 的毒性，以及 2) 帮助预测前驱期的表型转化，例如，75），建立准确的诊断和预后并实施预防保健。
更多信息和对资源和试剂的请求应直接联系主要联系人 Laurent Roybon ( Laurent.roybon@med.lu.se )，并将由其完成。
本研究生成了受材料转让协议和一般数据保护法规约束的 iPSC 生产线。脑样本来自荷兰脑库 ( https://www.brainbank.nl/ )、葡萄牙脑库 ( http://www.bancodecerebros.chporto.pt/ ) 和哥伦比亚大学的纽约脑库（http://columbianeuroresearch.org/taub/res-investigation.html#NewYork）（SI附录，表 S2）。
所有程序均按照国家和欧盟指令进行。用于生成 iPSC 的患者活检获得知情同意，并在意大利米兰帕金森研究所伦理委员会批准后获得：伦理委员会“米兰 C 区”（https://comitatoeticoareac.ospedaleniguarda.it/）并在号码：370-062015。重新编程许可证由瑞典工作环境管理局交付给 LR，注册号为 20200-3211。
iPSC 系 CSC-3G、CSC-3S、CSC-32B、CSC-32K 和 CSC-32R 的生成以前已发表 ( 6 , 15 , 32 )。最近描述了 CSC-28N、CSC-36C、CSC-36D 和 CSC-36E 系 ( 13 , 14 )。使用类似的方法从 MSA-C 患者（iPSC 系 CSC-30B；CSC-30C 和 CSC-30D）和 MSA-P 患者（iPSC 系 CSC-34D；CSC-34F 和 CSC-34M；SI 附录，图 S1）。
如前所述生成人类 iPSC ( 32 )。SNCA行程( 32 )的存在和 aSYN p.A53T 变异 ( 15 ) 的存在已被确认。为了评估生成的 iPSC 分化为三个胚层，将细胞作为胚状体在补充有 20 ng/mL FGF2 的 WiCell 培养基中培养，并铺在 96 孔板上进行自发分化，使用抗体的免疫荧光染色证实了这一点针对 β-III-微管蛋白 (Sigma-Aldrich, T8660, 1:200)、平滑肌肌动蛋白 (Sigma-Aldrich, A2547, 1:200) 和 α-甲胎蛋白 (Sigma-Aldrich, A8542, 1:200) ( SI附录，图 S1）。
人类 iPSC 衍生的OLC是使用先前描述的详细协议生成的 ( 6、18 ) 。
为了将 iPSC 分化为中脑多巴胺能神经元，遵循先前建立的方案 ( 76 )。
对于每个样品，使用预热的 Accutase 分离细胞，孵育 20 分钟，重悬于不含酚红的 GDM 培养基中，然后转移到 FACS 管中。离心后，将沉淀重悬于 Dulbecco's modified Eagle's medium/F12 中，不含酚红，含有 5% 正常血清和 O4 抗体。为了排除死细胞，加入 7-氨基放线菌素 D（1:1,000）并在冰上孵育 5 分钟，然后分选。在隆德大学的 MultiPark Cellomics and Flow Cytometry Core 技术平台上，使用 BD FACSAria III (BD Biosciences) 和 FACSDiva v8.0 软件 (BD Biosciences) 分析样品。使用 100-μm 喷嘴在 20 psi 标准压力和 30.0 kHz 频率下设置细胞仪，并使用 BD FACSDiva 细胞仪设置和跟踪 (CS&T) 软件和 CS& 每天校准
使用标准方案进行免疫细胞化学 (ICC) 和免疫组织化学。一抗在封闭溶液中稀释并在 4 °C 下孵育过夜：山羊抗 FOXA2（Santa Cruz，sc-6554, 1:250），小鼠抗 TH（Millipore，MAB1318, 1:500），山羊抗 SOX -10 (R&D, AF2867, 1:200), 兔抗 OLIG2 (Millipore, AB9610, 1:200), 小鼠抗 NKX2.2 (DSHB, 74.5A5, 1:50), 鸡抗 MAP2 (Abcam, ab92434, 1:2,500), 小鼠抗 O4 (由纽约市哥伦比亚大学的 J. Goldman 分享, 1:50), 兔抗 aSYN (Santa Cruz, SC7011-R, 1:200) , 鸡抗 MBP (Millipore, AB9348, 1:100), 兔抗 PSMB9 (Abcam, ab3328, 1:500), 小鼠抗 GFAP (Sigma-Aldrich, G3893, 1:400), 小鼠抗磷酸化α-突触核蛋白 (Ser129) 克隆 81A (Millipore, MABN826, 1:1,000) 和山羊抗 Olig2 (R&D, AF2418, 1:100)。第二天，在室温下在黑暗中以 1:400 在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 或 PBS-Tween 20 中使用适当的 Alexa Fluor 488、555 或 647 偶联二抗 1 小时。此外，细胞核被 6'-二脒基-2-苯基吲哚 (Sigma-Aldrich, D9542, 1:10,000) 染色。所有荧光显微照片均使用倒置落射荧光显微镜 (LRI – Olympus IX-73) 或共聚焦显微镜 (Leica TCS SP8 共聚焦显微镜 [Leica Microsystems] 配备二极管 405/405-nm 和 Argon (405-, 488-, 552- , 638-nm) 激光与 HP PL APO 63x/NA1.2 水浸物镜)。细胞核用 6'-二脒基-2-苯基吲哚 (Sigma-Aldrich, D9542, 1:10,000) 染色。所有荧光显微照片均使用倒置落射荧光显微镜 (LRI – Olympus IX-73) 或共聚焦显微镜 (Leica TCS SP8 共聚焦显微镜 [Leica Microsystems] 配备二极管 405/405-nm 和 Argon (405-, 488-, 552- , 638-nm) 激光与 HP PL APO 63x/NA1.2 水浸物镜)。细胞核用 6'-二脒基-2-苯基吲哚 (Sigma-Aldrich, D9542, 1:10,000) 染色。所有荧光显微照片均使用倒置落射荧光显微镜 (LRI – Olympus IX-73) 或共聚焦显微镜 (Leica TCS SP8 共聚焦显微镜 [Leica Microsystems] 配备二极管 405/405-nm 和 Argon (405-, 488-, 552- , 638-nm) 激光与 HP PL APO 63x/NA1.2 水浸物镜)。
用 RIPA 缓冲液溶解 100 天龄的球体和 130 天龄的贴壁培养物，并补充有 Halt Protease Inhibitor 和 Halt Phosphatase Inhibitor Mixtures。根据制造商的说明，使用 Pierce BCA 蛋白质测定试剂盒 (Thermo Fisher Scientific, 23227) 测定蛋白质浓度。将样品与上样缓冲液混合，在 70 °C 下加热 10 分钟，然后上样到 Bolt 4 至 12% Bis-Tris Plus 凝胶中。电泳后，将样品转移到聚偏二氟乙烯膜上。在 0.1% PBS-Tween 20 中稀释的 5% 脱脂牛奶或 5% 牛血清白蛋白（用于磷酸化蛋白）中封闭膜，并在 4 °C 下与在封闭溶液中稀释的靶一抗孵育过夜：小鼠抗β-肌动蛋白(Sigma-Aldrich, A5441, 1:20,000)，兔抗 aSYN (Cell Signaling, 2642S, 1: 500), 兔抗磷酸化 S129 (Abcam, ab1683811, 1:500), 兔抗 PDGFRα (Santa Cruz, sc-338, 1:200), 小鼠抗 MBP (Abcam, ab62631, 1:2,000), 兔抗-PSMB9 (Abcam, ab3328, 1:500) 和兔抗 C4b (Abcam, ab66791, 1:500)。第二天，将膜与辣根过氧化物酶偶联的二抗（R&D Systems，1:5,000）一起孵育 1 小时。然后使用 Pierce 增强化学发光溶液使印迹可视化，并在 Chemi-Doc 化学发光系统（Bio-Rad Laboratories）中成像。使用 Image Lab (Bio-Rad Laboratories) 对条带进行量化。使用 Restor PLUS Western Blot Stripping Buffer (Thermo Fisher Scientific, 46430) 为不同的标记物重新染色膜。1:2,000)、兔抗 PSMB9 (Abcam, ab3328, 1:500) 和兔抗 C4b (Abcam, ab66791, 1:500)。第二天，将膜与辣根过氧化物酶偶联的二抗（R&D Systems，1:5,000）一起孵育 1 小时。然后使用 Pierce 增强化学发光溶液使印迹可视化，并在 Chemi-Doc 化学发光系统（Bio-Rad Laboratories）中成像。使用 Image Lab (Bio-Rad Laboratories) 对条带进行量化。使用 Restor PLUS Western Blot Stripping Buffer (Thermo Fisher Scientific, 46430) 为不同的标记物重新染色膜。1:2,000)、兔抗 PSMB9 (Abcam, ab3328, 1:500) 和兔抗 C4b (Abcam, ab66791, 1:500)。第二天，将膜与辣根过氧化物酶偶联的二抗（R&D Systems，1:5,000）一起孵育 1 小时。然后使用 Pierce 增强化学发光溶液使印迹可视化，并在 Chemi-Doc 化学发光系统（Bio-Rad Laboratories）中成像。使用 Image Lab (Bio-Rad Laboratories) 对条带进行量化。使用 Restor PLUS Western Blot Stripping Buffer (Thermo Fisher Scientific, 46430) 为不同的标记物重新染色膜。然后使用 Pierce 增强化学发光溶液使印迹可视化，并在 Chemi-Doc 化学发光系统（Bio-Rad Laboratories）中成像。使用 Image Lab (Bio-Rad Laboratories) 对条带进行量化。使用 Restor PLUS Western Blot Stripping Buffer (Thermo Fisher Scientific, 46430) 为不同的标记物重新染色膜。然后使用 Pierce 增强化学发光溶液使印迹可视化，并在 Chemi-Doc 化学发光系统（Bio-Rad Laboratories）中成像。使用 Image Lab (Bio-Rad Laboratories) 对条带进行量化。使用 Restor PLUS Western Blot Stripping Buffer (Thermo Fisher Scientific, 46430) 为不同的标记物重新染色膜。
对年龄为 130 DIV 的 FACS 分选的 O4 + OLC 和年龄为 75 DIV 的含有多巴胺能神经元的球体进行 FTIR 显微光谱分析。洗涤细胞沉淀并在 1-mm 厚的 CaF 2分光光度窗口上铺展 (1 μL) 并在氮气流下干燥。为了重现性，红外 (IR) 光谱取自沉积在 CaF 2上的细胞沉淀的不同区域。背景光谱是从相同 CaF 2的干净区域测量的窗口，靠近细胞沉淀。光谱记录在与 Tensor 27 耦合的 Hyperion 3000 IR 显微镜（Bruker Scientific Instruments，Billerica，MA）上，Tensor 27 用作 IR 光源，带有 15Å∼ IR 物镜和碲化镉汞检测器。测量范围为 900 至 4,000 cm -1，光谱收集在透射模式下以 4 cm -1分辨率进行，共扫描 250 至 500 次。所有测量均在室温下进行。对于 FTIR 光谱分析，在大气补偿后使用 OPUS 软件 (Bruker) 和 Orange (University of Ljubljana)。使用具有 9 个平滑点的三阶多项式 3 的 Savitzky-Golay 将光谱推导到二阶用于揭示对应于 β-折叠结构 (1,628 cm-1）并消除基线贡献（77）。为了分析β-折叠结构内容，研究了1,628 cm -1 /1,656 cm -1带比( 78 )。
使用 U-PLEX Human α-Synuclein Kit (Meso Scale Discovery) 对 130 DIV 的 OLC 培养物的生长培养基中存在的 aSYN 进行量化。
第 110 天至第 115 天，在补充有鱼精蛋白的 GDM 培养基中，用逆转录病毒 pCMMP-haSYNWT-IRES2-eGFP-WPRE、逆转录病毒 pCMMP-haSYNA53T-IRES2-eGFP-WPRE 和逆转录病毒 pCMMP-IRES2-eGFP-WPRE 独立转导富集的少突胶质细胞培养物。在收集用于免疫细胞化学和 FACS 纯化/分析的样本之前，硫酸盐 (4 mg/mL) 1 至 2 周。细胞在 24 小时内开始表达 GFP（SI 附录，图 S6）。根据基因表达数据，转基因表达比内源性SNCA表达高 30 到 60 倍。
重组 WT aSYN 或 p.A53T aSYN 以冻干形式购自 Alexotech。为了用 ATTO-488 荧光标签共价标记 aSYN，我们将单体蛋白与新鲜溶解在二甲基亚砜 (Sigma-Aldrich) 中的活性 ATTO 染料一起孵育，如先前报道的 ( 11 )。根据制造商的说明 (GE Healthcare)，使用 GE Sephadex G-25 通过凝胶过滤色谱法去除非反应性染料。使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SI 附录，图 S6）确认共价标记，并且如先前报道的，通过蛋白质印迹和尺寸排阻色谱进一步分析标记的级分（12）。使用具有 3,000-MW 截止值 (Millipore) 的离心过滤器单元将标记的级分合并并浓缩至 5 mg/mL。为了生成 aSYN 原纤维，我们在 37 °C 下将 aSYN 单体 (5 mg/mL) 在 Eppendorf SS minishaker 中以 1,000 rpm 的速度持续振荡培养 5 天。然后将组装的蛋白质等分并储存在-80°C以供进一步分析。为了确认 aSYN 原纤维的形成，我们通过在测量荧光强度之前将 ThT (10 mM) 与单体和蛋白质组装体孵育来进行硫黄素 T (ThT) 分析。为了进一步可视化蛋白质组装，我们准备了用于透射电子显微镜 (TEM) 的样品。简而言之，将 5 μL aSYN 原纤维溶液沉积并吸附在 400 目碳涂层铜网格上。标本用 2% 乙酸双氧铀染色。这些图像是在配备 Olympus Veleta 相机的 120-kv Tecnai bioTWIN 显微镜中获得的。TEM 在隆德大学生物成像中心进行（https://www.lbic.lu.se/explore-our-infrastructure/microscopy）。对于治疗，110 至 115-DIV 富集的 OLC 培养物在 GDM 培养基中用 10 µM 单体或原纤维处理，并在样品收集前 1 至 2 周补充用于蛋白质印迹、ICC 或 FACS 纯化以进行转录组分析。
将总共 240,000 个 FACS 分选的 O4 + OLC 用 PBS 洗涤两次，将颗粒在液氮中速冻并储存在 -80 °C，然后运送到 Kompetenzzentrum Fluoreszente Bioanalytik（德国），使用人类 Clariom D 进行基因表达分析阵列（Affymetrix）。RNA 提取和样品制备在 Affymetrix 服务提供商和核心设施“KFB—荧光生物分析卓越中心”（Resensburg，德国）进行，并按照 Affymetrix GeneChip WT PLUS 试剂盒用户手册（Affymetrix，公司，加利福尼亚州圣克拉拉）。
使用 GraphPad Prism 7 软件或 R ( https://www.r-project.org/ ) 进行统计分析。数据表示为平均值±SEM。P值 <0.05 被认为是显着的：* P ≤ 0.05；** P≤0.01；*** P≤0.001；**** P ≤ 0.0001。如图图例所示，对样本组进行了非配对t检验或 ANOVA。
通过使用 GCCN-SST-RMA 算法和 Affymetrix GeneChip Expression Console v1.4 软件计算 log 2规模的汇总探针组信号。平均信号值、倍数变化的比较和显着性P值用 R 计算。通过在 R 中执行 Benjamini-Hochberg 错误发现率计算来调整P值以进行多重比较。我们将原始P值标记为重要基因(sig._p-value) 小于 0.05 并且小于相应的调整后P值，如先前所采用的 ( 14 , 67）。使用 ComplexHeatmap 2.4.3 版 ( 79 ) 制作了条件与对照之间基因表达和倍数变化的热图。使用 ggplot2 版本 3.3.0 ( 80 )绘制 log P值与 log 倍数变化的火山图。使用 WebGestalt 版本 0.4.4 ( 81 ) 进行 KEGG 通路分析。使用 WebGestalt（ http://www.webgestalt.org/）通过超几何分布和 GSEA 进行 GO 术语富集) 以 Reactome 和 KEGG 数据库为背景。为了评估可能的功能性蛋白质关联网络，我们通过 Cytoscape 使用 Stringdb 来检测基因显着上调或下调至少两倍。通过从每个表达数据集中过滤描述包含术语“脂质”的基因，生成在 OLC 中表达发生变化的脂质相关基因列表。从过滤列表中，通过仅保留在调整多重比较后显着的基因来生成与脂质代谢相关的基因子集。
以下补充材料可在https://10.1073/pnas.2111405119在线获取。
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