替西帕肽双肠促胰岛素受体激动的结构决定因素

意义

Tirzepatide 是葡萄糖依赖性促胰岛素多肽受体 (GIPR) 和胰高血糖素样肽-1 受体 (GLP-1R) 的双重激动剂，它们是调节碳水化合物代谢的肠促胰岛素受体。在 2 型糖尿病受试者的临床试验中，该研究药物已证明优于选择性 GLP-1R 激动剂。有趣的是，虽然 tirzepatide 在激活 GIPR 方面与天然 GIP 非常相似，但它在激活 GLP-1R 方面与 GLP-1 显着不同，从而导致激动剂诱导的受体脱敏作用较少。我们报告了低温电子显微镜和分子动力学模拟如何为 tirzepatide 的独特药理学提供结构基础。这些研究揭示了脂肪酸修饰与氨基酸序列相结合的程度，

抽象的

Tirzepatide (LY3298176) 是一种脂肪酸修饰的双肠促胰岛素受体激动剂，在葡萄糖依赖性促胰岛素多肽受体 (GIPR) 上表现出与天然 GIP 相似的药理学，但在胰高血糖素样肽 1 上表现出偏向于环磷酸腺苷信号传导受体（GLP-1R）。除了 GIPR 信号，GLP-1R 的通路偏差可能有助于 tirzepatide 在改善 2 型糖尿病中的葡萄糖控制和体重调节方面的功效。为了研究 tirzepatide 差异信号的结构基础，将机械药理学研究与低温电子显微镜结合起来。在这里，我们报告了与 GIPR 和 GLP-1R 复合的 tirzepatide 的高分辨率结构。与天然配体类似，tirzepatide 采用 α-螺旋构象，N 末端到达两个受体的跨膜核心深处。N末端酪氨酸（Tyr1）的分析^tirzepatide的 Tzp) 显示与 GLP-1R 的相互作用较弱。分子动力学模拟表明，与 GLP-1R 相比，tirzepatide 的脂质部分和 GIPR 之间更倾向于间歇性氢键，这与更紧凑的 tirzepatide-GIPR 复合物一致。根据这些分析，tirzepatide 被解构，揭示了一种受酰化依赖性信号转导影响的肽结构-活性关系。对于 GIPR，Tyr1 ^Tzp和其他在受体核心内产生强烈相互作用的残基允许 tirzepatide 耐受脂肪酸修饰，产生与 GIP 相等的亲和力。相反，与 GLP-1R 的细胞外结构域的高亲和力结合，再加上 Tyr1 ^{Tzp的稳定性降低}和脂质部分，促进偏向信号和减少受体脱敏。总之，这些研究为 tirzepatide 功能的结构决定因素提供了信息。

设计能够靶向多个受体系统的治疗性配体为发现更有效的复杂疾病治疗提供了机会，特别是对于干预多个信号通路可能有益的情况。一个这样的分子是 tirzepatide (LY3298176)，一种 39 个氨基酸的线性肽，对葡萄糖依赖性促胰岛素多肽受体 (GIPR) 和胰高血糖素样肽-1 受体 (GLP-1R) 具有激动剂活性 ( 1 , 2）。该分子的双重激动剂性质代表了一种有前途的治疗方式，用于治疗代谢紊乱，例如 2 型糖尿病 (T2DM)、肥胖症（包括射血分数保留的心力衰竭患者）和非酒精性脂肪性肝炎。这种治疗方法是建立在选择性 GLP-1R 激动剂的既定临床疗效的基础上，双功能概念是由两种受体的协同激活改善葡萄糖控制、能量平衡和脂质储存的假设所告知的 ( 3 , 4）。除了双重药理学之外，保持药物的有效浓度对于最大限度地提高此类治疗的益处很重要。因此，为了维持 tirzepatide 的作用，肽通过位于分子中间附近的赖氨酸通过亲水性接头与 C20 脂肪二酸部分结合 ( 2 )。这种脂肪酸修饰能够实现与人血清白蛋白的可逆、非共价结合，因此有助于形成每周一次给药的药代动力学特征 ( 1 )。

迄今为止，替西帕肽的临床开发项目取得了令人鼓舞的结果，数据显示血糖控制和能量代谢有所改善。在一项 26 周的 2b 期试验中确定了替西帕肽有效降低 T2DM 受试者的血糖和体重的功效 ( 5 )。此外，该试验的事后分析报告称，tirzepatide 治疗对胰岛素敏感性和胰腺 β 细胞功能的标志物具有良好的效果，并且还减少了致动脉粥样硬化的脂质颗粒 ( 6 , 7 )。有趣的是，胰岛素敏感性的改善在很大程度上与体重的变化无关（6）。这些数据支持启动 tirzepatide 的 3 期临床开发计划，称为 SURPASS ( 8 )，特别是 SURPASS-2（一项针对 T2DM 受试者的 40 周关键试验）报告的结果表明双重治疗的益处GIP/GLP-1 药理学 ( 9 )。在这项针对目前批准的最高剂量 GLP-1R 单激动剂 semaglutide 的头对头研究中，所有三种剂量的 tirzepatide 均能显着降低血糖和减轻体重。替西帕肽优越的临床疗效表明在 GLP-1 治疗中加入 GIP 药理学的优势。

由于临床数据，确定用替西帕肽治疗后代谢控制改善的机制是一个积极研究的领域。使用从Gipr或Glp-1r敲除小鼠中分离的胰岛进行的离体试验和在这两种模型中进行的葡萄糖耐量试验表明，替西帕肽可以通过任一受体增强胰岛素分泌并降低高血糖症 ( 1）。药理学上，受体特异性环磷酸腺苷 (cAMP) 积累测定表明，替西帕肽是一种不平衡的激动剂，有利于 GIPR 而不是 GLP-1R 活性；这些结果与结合数据一致，表明 tirzepatide 对 GIPR 的亲和力与 GIP 的亲和力相等，但在 GLP-1R 上比 GLP-1 弱约五倍 ( 1 , 10 )。研究结果支持强 GIPR 活性的益处表明 GIPR 激动通过独立于体重减轻的机制提高胰岛素敏感性 ( 11 )。此外，大脑中完整的 GIP 轴对于实现双重 GIPR 和 GLP-1R 激动剂治疗的完全厌食作用是必要的（12）。与这两个发现一致，GIPR 在脂肪组织和大脑中某些代谢控制中心的表达可能有助于 tirzepatide 的 GIP 成分的益处 ( 3 )。

同时，对 tirzepatide 在 GLP-1R 的药理学特征的研究表明，它显示出 cAMP 信号通路偏向于 β-arrestin 募集 ( 10 , 13 )。这一发现的重要性尚未完全实现，但可能是实质性的，因为有报道显示 GLP-1R 激动剂艾塞那肽的偏向类似物在啮齿动物模型中比非偏向母体分子更有效 ( 14 , 15 )）。总之，普遍的证据支持将有效的 GIPR 激动剂与偏向的 GLP-1R 信号相结合的治疗益处，与替西帕肽临床研究的有希望的结果一致。因此，本文进行和介绍的实验旨在更好地了解 tirzepatide 在分子水平上对 GIPR 和 GLP-1R 的独特配体结合和药理学特征。

结果和讨论

Tirzepatide 与 GIPR 和 GLP-1R 复合的低温电子显微镜 (Cryo-EM) 结构。

为了研究 tirzepatide 药理特性的分子基础，GIPR 与天然 GIP 复合物的高分辨率结构（3.2-Å 分辨率）以及与 tirzepatide 结合的 GIPR 和 GLP-1R（3.1-Å 和 2.9-Å 分辨率） ，分别）由冷冻电镜确定（图 1 A和SI 附录，图 S1 和 S2 以及表 S1）。配体被可靠地建模为密度图（SI 附录，图 S1 和 S2），GIP 和替西帕肽的残基 1 至 32 在结构中被解析，与在先前报道的结构中解析的 GLP-1 的长度相当GLP-1R ( 16 , 17）。重要的是，GIP/GIPR 结构确立了该受体的激活机制，并且与 GLP-1 和胰高血糖素与各自受体的复合物相似，GIP 采用连续螺旋构象 ( 16 , 18 )。N 末端插入跨膜 (TM) 结构域，通过广泛的极性和疏水相互作用与 TM1、TM2、TM3、TM5、TM7 和细胞外环 2 (ECL2) 中的残基接触（图 1 A和B）。值得注意的是，位置 1 的酪氨酸 (Tyr1 ^{GIP ) 被埋在 GIPR 的 TM 核心中，与 Gln224 3.37}形成氢键并与 Trp296 ^5.36进行芳香相互作用（图 1 B）。Tyr1 在 GIP 结合和受体激活中的关键作用得到了对 GIP 的截短或突变类似物的研究的支持 ( 19 , 20 )。最近已经描述了关于 GIP/GIPR 相互作用的决定因素的类似结果和结论 ( 21 )。与其与 GIP N 末端部分的序列相似性一致，tirzepatide 以类似的方式结合 GIPR（图 1 A和C）。tirzepatide 的 N 末端片段（~残基 1 至 14）的主链与 GIP 的等效片段大部分重叠（图 1 D和E）。尽管 tirzepatide 和 GIP 的大多数相互作用是相似的，但关键的区别是 tirzepatide 的第 7 位 (Thr7 ^Tzp ) 处的苏氨酸（相对于 GIP 中的异亮氨酸），它提供与 Arg190 ^2.67GIPR的氢键（图1D），模拟两者之间的相互作用等效的 Thr13 ^GLP-1和 Lys197 ^2.67GLP-1R ( 17 )。此外，Arg190 ^2.67GIPR的侧链与 GIP 结合结构的构象略有不同，使其更接近 Tyr1 ^Tzp。^{Tyr1 Tzp}的侧链采用不同的旋转异构体，羟基指向Arg190 ^2.67GIPR和 Gln220 ^3.33GIPR（图 1 D），冷冻电镜图表明这些残基之间存在水介导的极性相互作用（SI 附录，图 S3）。额外的相互作用表明 tirzepatide 的序列可以在 GIPR 促进更高的亲和力和效力特性。图 2。

图。1。

GIPR/GIP、GIPR/tirzepatide 和 GLP-1R/tirzepatide 的冷冻电镜结构测定。（一）GIPR（橙色）/GIP（黄色）的整体结构（3.2-Å分辨率）GIPR（洋红色）/tirzepatide（蓝色）（3.1-Å分辨率）和GLP-1R（石板蓝）/tirzepatide（绿色） ）（2.9-Å 分辨率）。复合物的其他亚基着色如下：GsαiN18，鲑鱼；Gβ，深绿色；Gγ，灰色；Nb35，棕色；ScFv16，紫褐色。( B , C ) GIP ( B ) 或替西帕肽 ( C ) 与 GIPR 的 TM 结构域的相互作用。参与相互作用的残基显示为棒，并标记了贡献最显着相互作用的残基。氢键被标记为破折号。( D) GIP 和替西帕肽第 7 位残基的差异。( E ) GIP 和 tirzepatide 与 GIPR 的 ECD 和 ECL1 的相互作用。

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图 2。

tirzepatide (TZP) 与 GLP-1 在 GLP-1R 的差异结合。（一）与 GLP-1R 结合的 TZP 的总体方向（GLP-1R 板岩蓝色；Tzp，绿色）与 GLP-1R（青色）/GLP-1（灰色）（PDB：6×18）相比，GIPR（橙色）/GIP（黄色）和 GIPR（洋红色）/Tzp（蓝色）。（乙）TZP 的位置远离 GLP-1R 的 ECL2，而 Arg299 ^ECL2不与 TZP 相互作用。参与显着相互作用的残基显示为棒。氢键标记为破折号。（C）Tyr1 ^Tzp的体积导致 Trp306 ^5.36的旋转异构体不同，破坏 GLP-1R 的 TM5 和 ECL3 之间的相互作用。

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GIP 的 C 末端（~残基 15 至 32）与细胞外结构域 (ECD) 和 ECL1 相互作用，总体而言，类似于与 GLP-1R 结合的 GLP-1 的相互作用模式 ( 16 )。ECD 以与先前对 GIPR 的孤立 ECD 的晶体学研究相同的方式参与 GIP ( 22 )，我们的研究通过显示 GIPR 的 ECL1 也有助于与 C 末端区域的相互作用提供了全面的理解的 GIP，最值得注意的是 His18 ^GIP和 Trp25 ^GIP（图 1 E）。与 GLP-1R ( 16 ) 和胰高血糖素受体 (GCGR) ( 23 )相比，ECL1 在 GIPR 中采用更扩展的构象)，其中形成 α 螺旋结构。ECL1中Pro195 ^GIPR、Pro197 ^GIPR、Pro199 ^GIPR的存在阻止了稳定二级结构的形成（图1E）。对于 tirzepatide，观察到类似于 GIP 结合结构中的 ECL1 构象（图 1 E），但与等效的 Cα 相比，tirzepatide 的 C 末端片段在 Trp25 的 Cα 处从 ECL1 倾斜约 3 Å GIP (图 1 E )。此外，GIP的His18 GIP和GIPR的Tyr36 ECD形成氢键，替^西帕肽^不存在氢键，因为它含有Ala18 ^Tzp（图 1 E）。有趣的是，与 GIP 相比，ECD-TM1 接头在 GIPR/tirzepatide 结构中的解析更好，这表明灵活性较低（SI 附录，图 S4）。另外值得注意的是，Lys20 Tzp 的^侧链在 ECD-TM1 接头末端向 Leu128 ^1.30GIPR延伸（ SI 附录，图 S4）。^{正如预期的那样，与 Lys20 Tzp}相连的脂肪酸部分在密度图中没有分辨出来。

总体而言，与 GLP-1 与 GLP-1R 结合的位置相比，GIP 和 tirzepatide 的螺旋在 GIPR 中的位置更远离 ECL2，更靠近 TM1，但 TM 的大多数其他成分对于 GIPR 和 GLP-1R对齐良好（SI附录，图S5）。在该位置，在 Tyr10 ^GIP或 Tyr10 ^Tzp与 Gln138 ^1.40GIPR之间形成氢键（图 1 B和C）。相比之下，等效的 Val16 ^GLP-1不与 Tyr145 ^1.40GLP-1R相互作用( 17 )。

尽管 GIPR/tirzepatide 结构在很大程度上类似于 GIPR/GIP 结构，但 GLP-1R/tirzepatide 结构表明 tirzepatide 以独特的方式与 GLP-1R 结合（图 2）。通过 TM 对齐结构显示配体的 N 末端占据相同的空间，但与 GLP-1R 复合的 tirzepatide 的 C 末端片段向其 ECL1 倾斜（图 2 A和SI 附录，图 S6 A ), 它采用与 GLP-1R/Ex-P5 结构 ( 24 ) ( SI 附录, 图 S6 B ) 和 GLP-1R/taspoglutide 复合物 ( 25 )中发现的构象相似的构象）。GLP-1R-ECL1 构象的灵活性适应具有不同序列的配体，在所有这些中，Trp214 ^ECL1与肽的 Phe-XX-Trp 基序的芳香残基进行重要的 pi-pi 相互作用（SI 附录，图 S6 C )。

图 3。

与 TZP 复合的 GIPR 和 GLP-1R 的 MD 模拟。( A ) 脂质修饰的化学结构及其与 TZP 的 Lys20 ^Tzp的连接。( B ) 在 MD 模拟过程中，脂质链与 TZP 的肽序列（左图）或受体（右图）观察到的氢键相互作用的频率。GIPR 的结果用蓝色条表示，GLP-1R 数据用红色表示。“X”表示受体复合物中相应残基不存在氢键相互作用。（C）脂质链在两个 500 纳秒 MD 上的回转分布半径分别在 GIPR（蓝色）和 GLP-1R（红色）复合物中运行。( D) GIPR（左）和 GLP-1R（右）中 TZP 的 MD 快照叠加。显示来自每个复杂系统的 100 纳秒间隔的 10 个快照。TZP 的肽部分显示为橙色带，脂质链显示为黄色条。

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尽管 tirzepatide 和 GLP-1 的总体方向有一些普遍的相似性，但对 GLP-1R/tirzepatide 和 GLP-1R/GLP-1 结构的详细分析揭示了它们的结合差异，这与 tirzepatide 的较弱亲和力一致 ( 10 , 16）。tirzepatide 的残基 2 到 9 的 Cα 原子与 GLP-1 的等效氨基酸（残基 8 到 15）很好地对齐，彼此之间的距离都在 1 Å 以内。从 Tyr10 ^{Tzp开始，它们的等效 Cα 原子之间的距离在随后的 2-氨基异丁酸 (Aib)13 Tzp}和 Tyr19 ^GLP-1处的螺旋转角内增加到约 2.2 Å （图 2 B）。虽然这是一个适度的差异，但 tirzepatide 位置的变化导致与 GLP-1R 的 ECL2 的相互作用较弱，这与确定 GLP-1R 的信号分布有关 ( 26 , 27 )。具体来说，介导与各种 GLP-1R 配体的极性相互作用 ( 17 ) 的 Arg299 ^ECL2不会与 tirzepatide 形成这种接触（图 2 B和SI 附录，图 S7 A）。Arg299 ^ECL2突变为丙氨酸会降低 GLP-1 激活 cAMP 信号传导的功效 ( 26 , 27）。另一方面，tirzepatide 位置的相对移动允许 Tyr10 ^Tzp和 Tyr145 ^1.40GLP-1R之间的 pi-pi 堆叠，通过其等效的 Tyr10 残基 ( 28 ) 模拟胃泌酸调节素的相互作用模式（图2B）。

tirzepatide 的 N 末端呈现出另一个关键特征，这可能导致其与 GLP-1R 结合的亲和力较弱。由于 Tyr1 ^Tzp (相对于 His7 ^GLP-1 ) 的侧链较大，Trp306 ^5.36GLP-1R采用交替的旋转异构体，这会导致与 GLP-1R/GLP-1 结构的构象相关的空间冲突（图2C和SI 附录，图 S7 B )。这种变化破坏了在 GLP-1R/GLP-1 结构中观察到的Trp306 ^5.36和 Asp372 ECL3^之间的氢键（图2C），类似于 GIPR/GIP 和 GIPR/tirzepatide 结构中的情况（SI 附录，图S7 C）。^{Trp306 5.36GLP-1R}的这种特定构象也改变了许多周围残基的构象，包括 GLP-1R-ECL2 和 Arg310 ^5.40GLP-1R的残基。此外， GLP-1R/GLP-1 结构中Arg310 ^5.40和 Glu373 ^ECL3之间的极性相互作用也在tirzepatide结合结构中丢失（图2C ）。由于 1 位存在酪氨酸与组氨酸，GLP-1R 的 TM5 和 ECL3 之间的极性相互作用消失了。之前的一份报告表明，ECL3 的稳定是 GLP-1R 完全、无偏的激动所必需的（29）。与稳定相互作用的丧失一致，GLP-1R/tirzepatide 结构中的 ECL3 在冷冻电镜图中显示出较弱的密度。值得注意的是，虽然完全埋在口袋中，但 Tyr1 ^Tzp和 Trp306 ^5.36GLP-1R的密度弱于其结合口袋的其他 tirzepatide 残基（SI 附录，图 S7 D），反映了它们在这种不太稳定的构象中的灵活性。

Tirzepatide 的接头-脂肪酸部分的动力学。

tirzepatide 的一个关键结构特征是 C20 脂肪二酸通过一个 L-γ-谷氨酸和两个 8-氨基-3,6-二氧辛酸 ( 2 )的接头连接到 Lys20 ^Tzp的侧链氮上（图 3一个）。在 tirzepatide 复合的 GLP-1R 和 GIPR cryo-EM 结构中，接头 - 脂肪酸部分和肽 C 末端（氨基酸 33 至 39，以下称为 Ct）均出现无序且未解析。尽管先前没有通过晶体学解决酰化肽与 GLP-1R 相互作用的结构方面 ( 30 )，但最近与 GLP-1R 结合的司美鲁肽（在位置 20 处含有 C18 二酸）的低温-EM 结构显示了一些密度对于脂质修饰（25 )。在这份关于 semaglutide 的报告中，对接头脂肪酸链的两种构象进行了建模，即一种与 ECD 相互作用，一种与膜相互作用 ( 25 )。

图 4。

TZP 的 C20 二酸脂肪酸部分影响肠促胰岛素受体结合亲和力。使用 TZP 进行了研究受体结合和信号转导的机制药理学研究，TZP 是其缺乏脂质部分的类似物 (TZP ^ΔC20 )，以及在位置 1 也含有组氨酸代替酪氨酸的衍生物 (TZP ^ΔC20,Y1H )。( A ) 对于每个配体，[ ¹²⁵ I]-GIP ( 1 – 42) 使用从表达人 GIPR 的 HEK293 细胞中分离的膜测定结合。TZP 的结合被证明等同于天然 GIP 的结合。C20 二酸脂肪酸链的去除增加了配体的亲和力，而将酪氨酸变为组氨酸削弱了与受体的结合。( B )使用 GIPR 表达膜进行Gα _{s 的}配体诱导的 GTPγS 结合。与 TZP 和 GIP 相比，从 TZP 中去除脂质部分导致 Gα _{s活化的效力适度增加，但相比之下，TZP} ^ΔC20,Y1H类似物的效力和效力均降低。( C) 在表达人 GIPR 的 HEK293 细胞中测量激动剂刺激的 cAMP 产生。与结合亲和力和激活 Gα _s效力的增加一致，脂质部分的缺失导致刺激 GIPR 介导的 cAMP 积累的效力增加，而在位置 1 的酪氨酸置换后观察到较弱的活性。（D）对于GLP-1R，[ ¹²⁵ I]-GLP-1(7-36)NH ₂结合的竞争性抑制使用分离自表达人GLP-1R的HEK293细胞的膜测定。TZP 和 TZP ^ΔC20的结合比 GLP-1 弱约五倍，但在位置 1 将酪氨酸变为组氨酸恢复了与天然肽的结合亲和力。(E）配体诱导的GTPγS结合Gαs_是使用表达GLP-1R的膜进行的。与 GLP-1 相比，TZP 被证明是刺激 Gα _s的部分激动剂。从 TZP 中去除脂质部分导致有效反应增加，观察到 TZP ^ΔC20,Y1H类似物的进一步升高。( F) 在表达 GLP-1R 的人 HEK293 细胞中测量激动剂刺激的 cAMP 产生。TZP 在刺激 cAMP 积累方面的效力比 GLP-1 弱 20 倍。脂质部分的缺失提高了效力，并且含有组氨酸的非脂质化母体肽显示出与 GLP-1 无法区分的活性。使用含有酪氨酸代替7位组氨酸的胰高血糖素样肽-1衍生物(GLP-1 ^H7Y )作为对照。提供的数据代表n ≥ 3 个独立实验。汇总数据见SI 附录表 2。日志 M; 记录摩尔。

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为了研究tirzepatide 的脂质修饰在肽-受体复合物中的分布，我们在C20 二酸共轭物、Ct 和其他未解析的原子中建模。然后对与异源三聚体 G 蛋白膜中的 GIPR 或 GLP-1R 复合的 tirzepatide 模型进行一系列 1-µsec 分子动力学 (MD) 显式溶剂模拟。结果表明，接头-脂肪酸链以多种构象存在（图3）。此外，在 MD 分析中，脂质部分与任一受体的特异性和持续相互作用的数量相对较少（图 3 B的右图））。MD 还表明脂质链和谷氨酰胺在 tirzepatide 的第 24 位之间的分子内氢键在 GIPR 中更普遍（大约 40% 的模拟时间）比在 GLP-1R 复合物中（大约 18% 的模拟时间，图 3 B的左面板）。总体而言，脂质部分与受体的间歇性氢键在 GIPR 中比在 GLP-1R 中更分布和普遍（图3B的右图）。与这些观察结果一致，发现 GIPR/tirzepatide 复合物中的二酸链比结合的 GLP-1R 复合物更紧凑，如其平均回转半径所示（GIPR 为 6.8 Å，GLP-为 7.6 Å） 1R) (图 3 C），同时保持脂质部分的溶剂可及表面积和极性表面积的相似分布（SI附录，图S8）。MD 快照（图 3 D）证明了两种受体中 tirzepatide 的构象多样性。

替西帕肽功能的药理学基础。

通过对与两种受体复合的 tirzepatide 的低温 EM 结构的分析以及在进行 MD 模拟时提出的假设，合成了一系列肽类似物以研究 tirzepatide 药理活性的分子基础。这是一种基于知识的设计方法，它解构了 tirzepatide 以评估其受体结合和信号传导特性。我们注意到，考虑到白蛋白和血清在生物测定中作为非特异性阻断剂的常见用途，脂肪酸修饰肽的白蛋白结合倾向可能会混淆分子的药理学比较。因此，为了避免这种情况，使用补充牛酪蛋白或杆菌肽的完全无白蛋白测定来防止非特异性结合 ( 10 )。

竞争结合测定表明，脂质侧链（TZP ^ΔC20）的去除产生的配体在 GIPR 处的亲和力比替西帕肽高约四倍（图 4A ）。替西帕肽的脂肪酸修饰特征对于该分子的持续药代动力学是必要的（1）。结合测定结果表明，较高亲和力的亲本肽是 tirzepatide 整体亲和力的重要贡献者，因为它允许添加最终导致 tirzepatide 与 GIP 具有相同亲和力的脂肪酸部分，这是其不平衡所需的特征效力药理学。类似于对亲和力的影响，脂质的去除提高了配体对刺激 GIPR 介导的 Gs 活化（图 4 B）和受体诱导的细胞内 cAMP 积累（图 4 C ）的效力。）。与具有与 GIP 相似的 GIPR 活性的双重 GIP/GLP-1 受体激动剂的治疗目的一致，tirzepatide 的氨基酸序列包含在 GIP 中发现的许多相同残基，尤其是位于 N -与 GIPR 结合口袋进行关键相互作用的配体的末端一半（图 1）。特别是，冷冻电镜结构的检查揭示了 GIP 和 tirzepatide 的 N 端酪氨酸在受体核心底部附近相互作用中的潜在重要性（图 1）。与该模型一致，将酪氨酸变为组氨酸（TZP ^ΔC20，Y1H）以匹配 GLP-1 的第一个位置，将结合亲和力减弱了 20 倍（图 4 A）。类似地，这种替代也降低了 Gs 激活和 cAMP 积累的功效（图 4 B和C）。这些结果表明了在这个位置的天然酪氨酸对于维持 GIPR 亲和力和完全激动的重要性。

图 5。

GLP-1R 处 TZP 的偏向药理学是通过 N 末端酪氨酸和 C20 二酸脂肪酸部分对信号传导功效的复合效应而发生的。使用 TZP 进行了研究受体结合和信号转导的机制药理学研究，TZP 是其缺乏脂质部分的类似物 (TZP ^ΔC20 )，以及在位置 1 也含有组氨酸代替酪氨酸的衍生物 (TZP ^ΔC20,Y1H )。使用 GRK2 ( A ) 和 β-arrestin ( B） 招聘。在这两个系统中，与 GLP-1 相比，TZP 被证明是一种较弱的部分激动剂。C20二酸脂肪酸部分的去除改善了反应，并且脂质部分的缺失与用组氨酸代替酪氨酸的组合导致几乎完全有效的活性。( C ) 使用 HEK293 细胞中 SNAP 标记受体的细胞表面呈现变化评估配体诱导的 GLP-1R 内化。相对于 GLP-1，TZP 被证明是诱导 GLP-1R 内化的弱的部分激动剂。与恢复 β-arrestin 募集一致，TZP ^ΔC20和 TZP ^ΔC20,Y1H衍生物显示成比例地改善配体诱导的受体内化。使用含有酪氨酸代替7位组氨酸的胰高血糖素样肽-1衍生物(GLP-1 ^H7Y )作为对照。提供的数据代表n ≥ 3 个独立实验。汇总数据见SI 附录表 2。（D-L ）用荧光标记的 GLP-1、TZP、TZP ^ΔC20、Y1H或 GIP标记的胰岛的代表性共聚焦图像。野生型 ( D , G , J ) 或Glp-1r null (F、I、L ) 用 30 nM GLP-1 ^AF647、TZP ^AF647、TZP ^{ΔC20、Y1H-AF647}或 (D-Ala2)GIP ^AF488处理 30 分钟的小鼠。（E、H、K ）在用荧光标记的配体处理之前，将来自野生型小鼠的另一组胰岛与 2 μM GLP-1R 拮抗剂 exendin-4 _{(9-39)预孵育。}用 Hoechst 33342 将细胞核染成蓝色。 log M; 记录摩尔。（比例尺，10 µm。）

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与模仿 GIP 作用的替西帕肽相比，它在 GLP-1R 的药理学不同于 GLP-1。先前的研究表明，tirzepatide 与 GLP-1R 结合的亲和力比 GLP-1 弱 5 倍，表现为刺激 Gs 活化的效力较弱和效力降低，cAMP 信号传导效力降低，配体诱导的 β-逮捕招募 ( 10）。从治疗的角度来看，对 cAMP 信号传导与 β-arrestin 募集的偏向可能有利于 tirzepatide 的 GLP-1 成分，因为它促进较少的激动剂诱导的脱敏。本报告中的研究结果进一步强调了替西帕肽在 GLP-1R 与 GIPR 的药理学差异。例如，与去除脂质后对GIPR的亲和力增加相反，替西帕肽结合GLP-1R的亲和力不受侧链损失的影响（图4D）。然而，非酰化类似物在 GLP-1R 刺激的 Gs 激活中表现出更高的功效（图 4 E）和在 cAMP 积累中更强的效力（图 4 F）。此外，在非酰化类似物中将 N 末端酪氨酸变为组氨酸进一步提高了效力，从而在这些测定中产生了与 GLP-1 功能接近的配体（图 4 E和F）。尽管非同源酪氨酸的影响与酰基修饰的存在相结合，降低了 GLP-1R 刺激的 Gs 信号传导的功效，但这种药理学特征仍然足以通过 GLP-1R 充分增强胰岛素分泌并减少高血糖，如前所述通过胰岛培养中的 tirzepatide 和Gipr缺失小鼠的葡萄糖耐量试验 ( 1 )。

对于 BG 类蛋白偶联受体 (GPCR)，包括 GIPR 和 GLP-1R，N 端 ECD 是一种独特的结构特征，与配体识别机制有关。有趣的是，在处理 GLP-1R/tirzepatide 冷冻电镜数据的过程中，三维 (3D) 分类揭示了一类独特的 GLP-1R/G 蛋白复合物，该复合物对 tirzepatide、完全无序的 ECD 和TM 结构域的敞开的细胞外袋（SI 附录，图 S2 和 S9）。鉴于 tirzepatide 对结合全长 GLP-1R 具有纳摩尔亲和力（图 4 D)，并且在样品制备过程中加入了饱和量的 tirzepatide，apo 复合物的存在表明 tirzepatide 与 GLP-1R TM 束的结合不如 ECD 稳定，这与为类提出的两步模型一致B GPCR ( 31 )。因此，为了直接评估 ECD 结合对配体亲和力的贡献，我们纯化了两种受体的 ECD，并使用表面等离子共振测量了肽配体的直接结合。发现配体以低微摩尔范围内的亲和力结合 GIPR 的 ECD，特别是 tirzepatide（平衡常数 [K _D ] = 4.2 µM）和 tirzepatide ^ΔC20（K _D = 1.7 µM），表明 tirzepatide 增强的受体亲和力^ΔC20主要独立于 GIPR 的 ECD 结合（SI 附录，图 S10）。相比之下，与 GLP-1R ECD 的结合对 tirzepatide (K _D = 23 nM) 的亲和力显着高于 tirzepatide ^ΔC20 (K _D = 111 nM) ( SI 附录，图 S10 )，这表明通过脂质部分可以通过与 GLP-1R 的 ECD 的相互作用来解释。

然后使用非 G 蛋白信号的测定来进一步研究 tirzepatide 在 GLP-1R 上的不同药理学。与先前的结果一致，显示 tirzepatide 诱导的 β-arrestin 募集到 GLP-1R ( 10 ) 的低功效/部分激动作用，tirzepatide 在募集 G 蛋白偶联受体激酶 2 (GRK2) 方面表现出相似的特征（图 5 A和B），它通过磷酸化受体来帮助终止信号传导，从而使 β-arrestins 能够结合（32）。在两种测定中对 tirzepatide 类似物的研究揭示了非酰化母体肽的募集功效适度增加，并且使用还包含酪氨酸-组氨酸替代物的配体实现了几乎全部功效（图 5 A和B）。由于激动剂诱导的受体内化通常由 β-抑制蛋白转运介导，因此使用 N 末端 SNAP-tag 系统评估类似物的 GLP-1R 内化。在这些实验中，在没有脂质的情况下，tirzepatide 诱导 GLP-1R 内化的效力和功效均大大增加（图 5C ）。第一个位置有组氨酸的配体 (TZP ^ΔC20,Y1H) 显示出进一步的轻微改善，导致在测定中与 GLP-1 等效（图 5C ）。

为了将这些发现扩展到异源细胞系统之外，合成了荧光标记的肽并将其用于正交实验以可视化胰岛中配体诱导的受体内化。在这些研究中，GLP-1 ^AF647、tirzepatide ^AF647、tirzepatide ^{ΔC20、Y1H-AF647}或 (D-Ala2)GIPR ^AF488在从野生型或Glp-1r缺失小鼠中分离的胰岛的静态培养物中孵育。共聚焦显微镜成像显示用标记的 GLP-1（图 5 D）或 tirzepatide ^ΔC20,Y1H（图 5 J ）处理) 导致部分配体在细胞内以点状荧光信号的形式出现在胰岛细胞的细胞质和核周区域中。标记的 GLP-1 和 tirzepatide ^ΔC20、Y1H的细胞内荧光强度分别为 104.5 ± 7.5 SEM ( n = 22) 和 85.3 ± 5.9 SEM ( n = 16)。然而，用 tirzepatide ^AF647孵育的胰岛细胞内荧光强度仅为 46.0 ± 3.6 SEM ( n = 30) (图 5 G )。作为对照，用 GLP-1R 拮抗剂 exendin-4 _(9-39) (图 5 E、H和K ) 或来自Glp-1r无效小鼠（图 5 F、I和L ）显示可忽略不计的细胞内荧光（在n ≥ 13时强度≤4.0 ），支持 GLP-1R 介导的配体内化机制。值得注意的是，荧光标记的 semaglutide 在处理过的胰岛中显示出与标记的 GLP-1 相似的细胞内染色（SI 附录，图 S11），这支持了脂质修饰通常不会阻止配体内化的观点。此外，我们推测缺乏明显的 GIPR 介导的配体内化是由于 GIP 内化程度的差异，正如先前报道的那样 ( 10 , 33)，和/或方法的灵敏度。总体而言，tirzepatide 通过 GRK2/β-arrestin 募集引起 GLP-1R 脱敏的能力有限，这与其无法诱导 GLP-1R 内化一致。

本报告中的研究共同调查了替西帕肽独特药理学特征的分子机制和结构决定因素。总体研究结果的总和指向一个模型，其中 GLP-1R 的偏向激动是由多种机制驱动的。与 tirzepatide 的 N 末端的关键相互作用与协调受体激活所必需的变构转变有关，其他偏向配体的情况也是如此 ( 24 , 29 , 34 )。与先前的研究一致 ( 35 , 36)，我们观察到，tirzepatide C 末端的 exendin-4 同源序列促进了与 GLP-1R 相对于 GIPR 的高亲和力相互作用。由于 B 类肽结合的经典两步机制的性质 ( 31 )，tirzepatide 的 ECD 驱动的亲和力可能为 N 末端残基修饰带来药理学机会，同时保持全长受体结合亲和力。规范 B 类 GPCR 配体的 N 末端的修饰已被充分证明可以改变传感器的功效 ( 14 , 37 – 39 )。最近对 B 类 GPCR 激活的见解表明，异源三聚体 G 蛋白的激活是一种复杂的多步骤机制 ( 40 , 41），但关于β-抑制蛋白募集的机制尚不清楚。我们之前观察到，tirzepatide 在 GLP-1R ( 10 ) 处对 G 蛋白活化表现出部分激动作用，这可能代表了偏向激动剂药理学的核心机制。

总之，肽疗法代表了一种越来越重要的药物发现方式（42）。通常，脂肪酸修饰被用作提高肽的体内半衰期的有效方法。这在很大程度上是因为酰化肽与血清白蛋白的结合保护了它们免受蛋白水解和排泄。我们证明肽结构活性关系（SAR）受受体和信号转导依赖方式的酰化影响/决定。因此，替西帕肽的药理学特征由肽序列和脂质部分的存在共同决定。独特的是，tirzepatide 与酪氨酸 1 组合的脂质修饰是降低 tirzepatide 对 GRK2 和 β-arrestin 募集以及因此被 GLP-1R 内化的功效的关键特征。出奇，酰化的作用是不同的，因为分子的非肽部分降低了 GIPR 的亲和力，但降低了 GLP-1R 的功效。对肽和脂质修饰的 SAR 可以驱动微妙但潜在的显着药理作用（部分或偏向激动）的认识表明，新疗法的设计应包含更广泛的药理学、结构和计算方法，以了解两者之间的复杂相互作用。受体和酰基肽药物。

方法

配体。

所有肽均在 Eli Lilly and Company 使用标准固相肽合成方法合成，该方法采用 Fmoc 保护基团策略，使用载量为 0.35 至 0.88 mmol/g 的 Rink-酰胺树脂。通过掺入 FMOC -L获得含有接头-脂肪酸修饰的类似物-Lys(Mtt)-OH 残基在适当位置，与 N 末端残基的 Boc 保护串联。在使用标准 Fmoc 化学逐步合成接头-脂肪酸基团之前，通过在二氯甲烷中用 30% 六氟异丙醇处理实现 Mtt 保护基的正交去除。合成完成后，通过用三氟乙酸 (TFA)/水/三异丙基硅烷/1,2-乙二硫醇 (EDT) (85:5:5:5) 处理 2 小时，将肽从树脂上裂解下来，然后沉淀和用冷乙醚洗涤。肽通过反相高效液相色谱 (RP-HPLC) 使用乙腈和含有 0.1% TFA 的水梯度纯化，纯度≥95%。选择的类似物在其 C 末端进行荧光标记，首先通过掺入一个额外的 C 末端 Fmoc-L -Lys(Mtt)-OH 残基，在剩余序列的合成和如上所述的纯化之前，类似地用炔丙基-PEG2-酸(Broadpharm)进行去保护和功能化。然后使用铜催化的叠氮化物-炔烃环加成化学在水/二甲基甲酰胺 (1:1) 中将所得的炔标记肽前体与 AFDye 647 叠氮化物 (Click Chemistry Tools) 或 AFDye 488 叠氮化物 (Sigma Aldrich) 缀合，并通过 RP-再纯化高效液相色谱法。正变构调节剂 (PAM) 如下： LSN3451217 (4-[(3 S )-2-[(2-羟基-4-异丙基-苯基)甲基]-6-甲氧基-3-(甲氧基甲基)-3, 4-二氢-1H-异喹啉-5-基]-2-甲基苯酚盐酸盐）和LSN3556672（2-氟-6-（异丁基氨基）-4-[(1 R )-2-[(1 S ))-1-(4-异丙基苯基)乙基]-6-甲氧基-1-甲基-3,4-二氢-1H-异喹啉-5-基]苯酚二盐酸盐)。这些化合物分别是 GLP-1R 和 GIPR 的调节剂，用于帮助形成稳定的 tirzepatide 与受体复合物。

构建体和昆虫细胞表达。

将人 GIPR（残基 24 到 466）和 GLP-1R（残基 24 到 422）cDNA 亚克隆到含有 N 端 FLAG 标签和 3C 蛋白酶位点的 pFastBac1 载体中。用根据制造商的方案生产的 P2 病毒感染 Sf9 细胞以产生表达 GIPR 和 GLP-1R 的细胞团块。人 Gsα 亚基经过修饰，其 N 末端的 1 至 25 个残基被人 Gαi 的 1 至 18 个残基取代，以允许单链可变片段 scFv16 作为稳定伴侣结合 ( 43）。这种名为 GsαiN18 的构建体被克隆到 pVL1392 中。将人 Gβ1 和 Gγ2 克隆到同一载体上的 pFastBac Dual 中。P2 病毒原液是根据制造商的方案生产的。Hi-5 细胞被 GsαiN18 和 Gβ1-Gγ2 病毒感染以产生异源三聚体 GsiN18 蛋白细胞团块。

复杂的形成和纯化。

GIPR/GIP 复合物和 GIPR/tirzepatide 和 GLP-1R/tirzepatide 复合物是用类似的策略形成和纯化的，因此一起描述。记录了特定于单个样本的步骤和细节。异三聚体 GsiN18 通过 Ni 亲和柱和离子交换色谱法 ( 44 ) 进行纯化。scFv16 和 Nb35 如前所述生产 ( 43 , 44）。受体/G蛋白复合物（在下文中称为复合物）在膜中形成。为了制备复合样品，将表达相应受体的 Sf9 细胞团块裂解，收集并清洗膜样品。通过将纯化摩尔过量的异源三聚体 GsiN18、Nb35、scFv16 和 10 μM 的相应肽（GIP 或 tirzepatide）与膜孵育过夜，形成复合物。对于 GIPR/tirzepatide 和 GLP-1R/tirzepatide 样品，分别添加了 10 µM LSN3556672 和 LSN3451217。将样品溶解在由 1% DDM、0.5% 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-丙磺酸水合物、0.2% 胆固醇半琥珀酸酯 (CHS)、30 mM Hepes (pH 7.8)、150 mM NaCl、30 % 甘油，25 µM 三（2-羧乙基）膦，2.5 mg/mL 亮肽素，0.16 mg/mL 苯甲脒，GIPR/tirzepatide 和 GLP-1R/tirzepatide 样品的 1 µM 肽和 2 µM 各自的 PAM。然后使用抗-FLAG M1树脂通过亲和层析纯化复合物。对于 GIPR/GIP 和 GIPR/tirzepatide 纯化，用含有高（1% DDM、0.5% CHAPS、0.2% CHS）和低（0.1% DDM、0.05% CHAPS、0.02% CHS）洗涤剂浓度的缓冲液洗涤树脂，或者. 缓冲液的其他成分相同，如下所示：30 mM Hepes (pH 7.8)、150 mM NaCl、10% 甘油、25 µM TCEP、1 µM tirzepatide 和 2 µM PAM。每个缓冲液使用的体积是 12 个柱体积。对于 GLP-1R/tirzepatide 样品，用 10 个柱体积的 0.1% DDM、0.05% CHAPS、0.02% CHS、30 mM Hepes pH 7.8、150 mM NaCl、10% 甘油、25 µM TCEP、1 µM 洗涤树脂tirzepatide 和 2 µM 的 PAM。洗完后，样品在由 30 mM Hepes (pH 7.5)、150 mM NaCl、2.5 mM CaCl2、1 μM 相应肽、2 μM 相应 PAM、25 μM TCEP、0.25% 组成的缓冲液中逐步交换月桂基麦芽糖新戊二醇 (MNG; NG310 Anatrace)、0.25% GDN101 (Anatrace)、0.048% 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-1'-rac-glycerol (POPG; Avanti) 和 0.03 ％胆固醇（Sigma-Aldrich）。使用 Superdex S200 10/300 GL 柱，使用具有 30 mM Hepes (pH 7.5)、150 mM NaCl、1 μM 相应肽和 2 μM 相应 PAM 的运行缓冲液的 Superdex S200 10/300 GL 柱洗脱和进一步纯化复合物， 100 μM TCEP、0.015% MNG、0.005% GDN101、0.00192% POPG 和 0.0012% 胆固醇。收集单体复合物的部分并单独浓缩用于电子显微镜实验。

Cryo-EM 数据采集和处理。

将浓度约为 10 mg/mL 的 3.5 µL 纯化复合物样品应用于辉光放电多孔碳网格（Quantifoil R1.2/1.3, 200 目），随后使用 Vitrobot Mark IV（Thermo Fisher Scientific）进行玻璃化。使用带有能量过滤器的 Titan Krios 电子显微镜 (Thermo Fisher Scientific) 使用 K3 Summit 直接电子检测器 (Gatan, Inc.) 在计数模式下在 300 kV 加速电压下工作，使样本可视化。数据收集的统计数据显示在SI 附录表 S1中。

数据处理在 Relion3.1 ( 45 ) 中进行。使用 MotionCor2 ( 46 )对剂量分割的图像堆栈进行光束诱导运动校正。每张显微照片的对比度传递函数 (CTF) 参数由 Gctf ( 47 ) 确定。在后续步骤之前，根据其质量和 CTF 估计分辨率手动选择显微照片。在像素大小为 1.64 Å 的分箱数据集上执行具有二维 (2D) 和 3D 分类的粒子选择。使用来自先前报道的 GLP-1R/GLP-1/Gs/Nb35 复合物的模板进行半自动粒子选择（16); 这些粒子进行了 2D 和 3D 分类。在 3D 分类之后，选择生成最佳 3D 地图的粒子类别，并将这些粒子的未合并版本用作 3D 自动细化的输入。应用贝叶斯抛光和 CTF 细化 ( 48 ) 来进一步改进地图。单个样品的流程图显示在SI 附录中，无花果。S1 和 S2。报告的分辨率基于使用 0.143 标准的金标准傅立叶壳相关性（SI 附录，图 S1 和 S2）。

模型构建和细化。

通过报告的 GLP-1R/GLP-1/Gs/Nb35 结构（RCSB 蛋白质数据库代码 6VCB）的刚体拟合完成初始模型构建。当适用于各自的模型时，该序列被突变以匹配 GIPR、GIP 或 tirzepatide。然后，初始模型分别在 Coot ( 49 , 50 ) 和 Phenix ( 51 )中进行迭代的手动和真实空间细化。目视检查最终模型与地图的总体拟合，并使用 Molprobity ( 52 ) 进一步评估几何形状。模型的最终细化统计数据汇总在SI 附录表 S1中。

原子坐标和低温电磁密度图已保存在蛋白质数据库 (PDB) 和电子显微镜数据库 (EMDB) 中。登录号如下：GIPR/GIP（PDB：7RA3；EMDB：EMD-24334）、GIPR/tirzepatide（PDB：7RBT；EMDB：EMD-24401）、GLP-1R/tirzepatide（PDB：7RGP；EMDB：EMD） -24453）和 GLP-1R apo 形式（PDB：7RG9；EMDB：EMD-24445）。

MD 模拟。

使用同源建模过程和 MOE（分子操作环境）。^{与 Lys20 Tzp}缀合的接头-脂肪酸脂质链和在冷冻电镜结构中未观察到的 C 末端 33 至 39 个残基被建模为扩展构象，并远离受体作为初始结构模型，以避免引入与受体的人为偏向相互作用。使用薛定谔软件（202.3 版），用受约束的重原子进一步将复杂结构的能量最小化。然后将具有3点水和磷脂酰胆碱膜的可转移分子间电位添加到运行MD的复杂系统中。膜位置设置为GIPR中受体残基136至159、172至193、215至239、258至280、294至318、339至362和372至395；和 GLP-1R 中的 143 至 165、179 至 200、225 至 249、268 至 290、304 至 329、350 至 373 和 381 至 405。² ))，受体、肽和调节剂的ECD不受限制。系统包含 220K 原子，并且使用 OPLS3e 力场 ( 53 ) 使用 Desmond MD 包运行模拟。进行了分析，忽略了轨迹的前 10 纳秒。在模拟过程中监测回转半径、氢键和极性表面积。所有 MD 模拟和分析均使用 Schrodinger 软件（版本 2020.3）在 V100 Nvidia 图形处理单元上进行。

体外药理学。

重组人 GIPR 和 GLP-1R 表达细胞系、cAMP 积累测定、[ ³⁵ S]GTPγS 结合测定、NanoBRET β-arrestin 1 募集和 [ ¹²⁵ I]-GLP-1(7-36)NH ₂和 [ ¹²⁵ I ]-GIP ( 1 – 42 ) 放射性配体结合研究完全按照参考文献10中的描述进行。

GRK2 对 GLP-1R 的募集通过 NanoBRET 方法进行量化（54）。基于 pcDNA3.1 的载体编码 NanoLuc，融合到 GRK2 的 N 端 (NP_001610) 以及 GLP-1R 和 HaloTag 的 C 端融合，用于转染自由式 HEK 细胞 ( 55 )。48 小时后，将转染的细胞在含有 0.1% (wt/vol) 牛酪蛋白和不同浓度配体的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中孵育。使用 Nano-Glo 底物作为供体和 NanoBRET 618 配体作为受体启动生物发光共振能量转移 (BRET)。在 460 nm 和 610 nm 处测量发射，并计算 BRET 比率。将融合蛋白的配体诱导的相互作用作为最大 GLP-1 的百分比与配体浓度作图。

为了评估配体诱导的受体内化，表达 SNAP-GLP-1R 的 HEK293 细胞用 100 nM Tag-Lite SNAP-Lumi4-Tb（供体）标记，洗涤并在含有 100 µM 荧光素-O' 乙酸的 Opti-MEM 中孵育（受体）。然后加入不同浓度的配体，并将混合物在 5% CO ₂ /37 °C 下孵育。使用 EnVision 读板器收集数据。将与最大 GLP-1 相比的内化百分比与配体浓度作图。先前报道了上述程序的其他实验细节（10）。所有测定的数据均符合 Genedata Screener 17 或 GraphPad Prism 9 软件中的四参数逻辑模型。

ECD 结合试验。

分离的人 GIPR（氨基酸 26 至 138）和 GLP-1R（氨基酸 24 至 145）的 ECD 在 CHO 细胞中表达为 6His 标记的分泌蛋白。将编码每种蛋白质的 DNA 转染到 CHO 细胞中进行表达。表达后，通过亲和色谱法（HIS-Trap Ni，Cytiva）纯化蛋白质，然后使用带有 PBS 缓冲液的 HiLoad 26/600 Superdex 75pg 柱（Cytiva）进行尺寸排阻色谱法。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析级分，合并符合纯化标准的级分，然后过滤0.22μm。使用 Biacore T200 (Cytiva) 进行表面等离子体共振测量，并使用 T200 评估软件版本 3.1 进行分析。使用 Biacore T200 控制软件 2.0.2 版中的胺偶联固定向导将受体胞外域蛋白共价固定（~250 个共振单位）在传感器芯片 CM4 BR100534 上。运行缓冲液为 HBS-EP（10 mM Hepes、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.05% P20 [pH 7.6]；Teknova）。通过在运行缓冲液中连续稀释来制备每个样品的浓度系列。样品以 30-µL/min 的流速注入 150 秒，然后解离 300 秒。用 10 mM 甘氨酸 (pH 1.7) 在样品之间再生表面。样品以 30-µL/min 的流速注入 150 秒，然后解离 300 秒。用 10 mM 甘氨酸 (pH 1.7) 在样品之间再生表面。样品以 30-µL/min 的流速注入 150 秒，然后解离 300 秒。用 10 mM 甘氨酸 (pH 1.7) 在样品之间再生表面。

胰岛的标签。

如前所述 ( 56 ) 分离小鼠和大鼠胰岛，使其在含有 10% 胎牛血清 (FBS) 的 RPMI 1640 培养基 (Gibco) 中恢复 48 小时，然后使用 Cell Tak 细胞粘合剂 (Corning ) 在含有 0.5% FBS 的 RPMI 1640 培养基中，在 5% CO ₂ /37 °C 下培养 120 分钟。对于受体特异性，在粘附阶段的最后一小时，将一部分胰岛与 2 µM exendin-4 _(9-39)一起孵育以评估 GLP-1R 结合。胰岛在含有 0.1% 酪蛋白的 Hank 平衡盐溶液和 5% CO _{2的检测缓冲液中用荧光配体（10 至 30 nM）标记 30 分钟}/37 °C。背景荧光在仅与测定缓冲液一起孵育的胰岛上测定。标记后，用 PBS 快速洗涤胰岛两次以去除未结合的荧光，然后立即将其固定在 4% 多聚甲醛、0.1% Tween20 和 0.4 µg/mL Hoechst 33342 中，在室温下放置 30 分钟。使用带有 63× 油物镜的 Zeiss LSM800 共聚焦显微镜对小鼠胰岛进行成像。对于大鼠胰岛，固定后，胰岛在室温下用 125 nM AlexaFluor488 Phalloidin（Thermo Fisher Scientific）染色 20 分钟以检测细胞膜。然后，在 LSM800 上使用 Airyscan 拍摄图像，并使用 Zen 软件（Blue edition 2.3 lite，Zeiss）进行解卷积。定量也使用 Zen 软件完成。使用直径为 5 µm 的圆形工具在核周区域测量单个胰岛细胞的细胞内荧光强度。通过减去从载体处理的胰岛记录的荧光强度来校正背景强度值。从两到五个单独的胰岛图像中从至少四个单独的细胞中采集数据。数据报告为平均值±SEM。