帕金森病（PD）是全球第二大神经系统退行性疾病，以α-突触核蛋白（α-Syn）在神经元内沉积导致神经元变性死亡为主要病理表现。这种病理蛋白有一个很重要的特点，“朊蛋白样”特性，也就是说错误折叠的α-Syn可以沿着神经元在大脑中进行传播，但传播机制尚不清楚。
近几年学术界逐渐流行起“肠脑轴”的概念，认为肠道菌群失衡也会导致肠神经α-Syn错误折叠，这些病理性的α-Syn可以沿着迷走神经一路上行，经过延髓迷走神经背核传入中脑，导致中脑多巴胺能神经元的死亡和PD运动症状的出现[1]。已经有证据表明，神经元活动可能对病理蛋白的传播和聚集产生影响，但具体影响机制还没有研究[2]。
近日，来自德国神经退行性疾病研究中心和美国帕金森病研究协会的科学家依据“肠脑轴”的理论，联合研究发现α-Syn由延髓传向中脑的速度与神经元活性密切相关，神经元过度激活导致的氧化应激可加速α-Syn的传播。该成果发表在Science advances杂志上[3]。
由于在“肠脑轴”的学说中，延髓迷走神经背核是病理蛋白传播入脑的起点，研究者们使用LoxP-Cre技术，在小鼠迷走神经背核中特异性表达人源性α-Syn。
在小鼠中转入人源性α-Syn表达序列，该序列只有在Cre诱导下才能表达，通过在迷走神经中注射Cre-AAV，在注射4-6周后可以观察到迷走神经背核中人源性α-Syn RNA和蛋白水平的增加。而在上游脑区（脑桥、中脑、端脑），无法观察到人源性α-Syn mRNA的转录，但却观察到人源性α-Syn的沉积。这说明人源性α-Syn在小鼠大脑中可以自发由延髓向中脑及端脑传播。
图示人源性α-Syn注射后4-6周在脑内自发传播
接下来为了观察神经元活动对传播的影响，研究者们使用了另一种工具：只由特定药物激活性受体（DREADD）。同样通过AAV病毒注射，分别在迷走神经背核内表达hM3D（激动受体）和hM4D（抑制受体）两种受体。在这两种受体在神经元表达的情况下，向小鼠腹腔内注射CNO这种药物，神经元放电就会被药物调控。表达hM3D的神经元会被显著激活而表达hM4D的神经元被显著抑制。通过c-fos染色和电生理实验，我们可以明确神经元的激活情况。
研究者们首先向小鼠一侧迷走神经注射了Cre和DREADD混合AAV，3周后向小鼠腹腔注射CNO或者生理盐水。注射CNO/生理盐水2周后取脑观察。结果发现，在神经元过度激活的情况下，人源性α-Syn由延髓向上端的传播密度（阳性神经元数量）和传播距离（阳性神经元距迷走神经背核距离）都有了显著性的提高。而在神经元电活动受到抑制的条件下，α-Syn的传播也明显缩短了。
左图示神经元过度激活后α-Syn传播能力增强，右图示神经元过度抑制后α-Syn传播能力减弱
神经元的过度激活常常伴随着氧化应激反应，而硝基化修饰是介导α-Syn沉积的关键机制。既往研究表明超氧化物的产生可以介导α-Syn的硝基化[4]。所以，在接下来的实验中，研究者们在上述模型的基础上对小鼠腹腔注射了超氧化物荧光探针（DHE），探究神经元过度激活→过氧化物产生→α-Syn的传播这条通路。
研究发现神经元的过度激活的一侧大脑中，同时存在超氧化物信号的增强和人源性α-Syn的传播增强，同时，人源性α-Syn的硝基化水平也显著提升。这种氧化应激反应也影响了神经元中的线粒体功能，通过对硝基化的NDUFB8进行染色，发现过度激活的神经元中也存在线粒体硝基化损伤。
图示神经元过度激活后氧化应激（左上），线粒体损伤（左下）和α-Syn硝基化修饰（右侧）水平均升高
总结一下上述的研究成果：人源性α-Syn可在小鼠神经元间传播。在神经元过度激活时，可以同时观察到α-Syn传播能力增强、硝基化水平增加，和神经元氧化应激增强、线粒体损伤加剧。那么，α-Syn传播能力的增强和氧化应激有没有直接关系呢？
SOD大家都很熟悉了，是超氧化物清除蛋白，具有强大的抗氧化能力。研究者们又对硝基化的SOD2进行了染色，发现过度激活的神经元中硝基化的SOD2也增多了。于是研究者们在前面的小鼠模型基础上过表达了SOD2，同样是通过AAV注射表达在迷走神经背核中（这组小鼠承受了太多）。
在SOD2过表达后，人源性α-Syn的表达水平在mRNA层面上没有下降，但通过计算α-Syn阳性神经元数量、阳性范围距离迷走神经背核距离、以及α-Syn染色强度，研究者观察到α-Syn的传播范围和传播效率都有了明显的下降，α-Syn的硝基化水平也显著降低了。
相应的，神经元内的氧化应激和线粒体损伤也明显减轻。使用针对人源性α-Syn的寡聚体进行染色，发现SOD2过表达后产生的寡聚体数量也明显下降，这说明氧化应激的抑制不仅抑制了α-Syn的传播，还抑制了α-Syn的聚集。
图示SOD2过表达后α-Syn传播的细胞数量、传播距离、传播密度均下降，α-Syn硝基化水平降低
在临床上，同样是帕金森病，不同的患者临床进展情况却千差万别：有的病人发病十几年依然症状很轻，服用多巴胺替代药物后与正常人无异；有的病人却在5年之内迅速进展至病理晚期，生活无法自理，这可能就与α-Syn传播速度与介导神经元死亡的程度有关。
本研究的发现将神经元活动，氧化应激与线粒体损伤和α-Syn传播与沉积相关的证据连成一条线索，向我们展示了它们的因果关系。也许我们不能调控神经元的活动，但我们却可以调节氧化应激反应，也许未来的一天，我们可以迎来帕金森病新的疾病修饰治疗手段。
病理蛋白如何产生，如何传播一直都是神经退行性疾病领域不断探索的重点。尽管遭遇了很多挫折，针对α-Syn的单抗临床研究均宣告失败，但每一次的向前探索，我们都更加能够接近真相。也希望终有一天，帕金森病的诊治可以真的获得突破。
参考资料：
[1]Ulusoy A, Phillips RJ, Helwig M, Klinkenberg M, Powley TL, Di Monte DA. Brain-to-stomach transfer of α-synuclein via vagal preganglionic projections. Acta Neuropathol. 2017;133(3):381-393. doi:10.1007/s00401-016-1661-y
[2] Wu Q, Shaikh MA, Meymand ES, et al. Neuronal activity modulates alpha-synuclein aggregation and spreading in organotypic brain slice cultures and in vivo. Acta Neuropathol. 2020;140(6):831-849. doi:10.1007/s00401-020-02227-6
[3]Helwig M, Ulusoy A, Rollar A, et al. Neuronal hyperactivity-induced oxidant stress promotes in vivo α-synuclein brain spreading. Sci Adv. 2022;8(35):eabn0356. doi:10.1126/sciadv.abn0356
[4]Schildknecht S, Gerding HR, Karreman C, et al. Oxidative and nitrative alpha-synuclein modifications and proteostatic stress: implications for disease mechanisms and interventions in synucleinopathies. J Neurochem. 2013;125(4):491-511. doi:10.1111/jnc.12226
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