来源：生物谷原创 2023-09-23 14:16
先导编辑（prime editing）技术使得科学家们能够以多种方式精确编辑基因组，有朝一日可用于治疗遗传疾病。如今，在一项新的研究中，来自美国布罗德研究所的研究人员利用最先进的实验室连续进化和工程方
先导编辑（prime editing）技术使得科学家们能够以多种方式精确编辑基因组，有朝一日可用于治疗遗传疾病。如今，在一项新的研究中，来自美国布罗德研究所的研究人员利用最先进的实验室连续进化和工程方法，开发出了这种基因编辑工具的改进版本。相关研究结果发表在2023年8月31日的Cell期刊上，论文标题为“Phage-assisted evolution and protein engineering yield compact, efficient prime editors”。
与以前的版本相比，他们的新编辑器更高效、更专业，能够修饰体外细胞培养物中和动物体内难以编辑的DNA，包括免疫系统细胞和大脑内部的DNA。这种编辑器的体积也更小，可能更容易将它们递送到身体关键部位的细胞中，作为新的疾病治疗手段。
先导编辑可以对DNA进行有针对性的插入、删除和其他更改，该技术由布罗德研究所梅金医疗保健变革技术研究所主任David Liu教授及其团队于2019年首次描述。该技术结合了多种分子机器：一种功能失效但可以在DNA上产生切口的Cas9蛋白；一种用于工程化的先导编辑向导RNA（prime editing guide RNA, pegRNA），既能指定编辑的位置，又包含插入在该位置的新遗传指令；以及一种称为逆转录酶（reverse transcriptase）的工程化酶，它以该RNA为模板，对DNA进行特定的改变。
过去，布罗德研究所的研究人员曾对 pegRNA 和细胞对先导编辑的反应方式进行过优化，以提高编辑效率。在这项新的研究中，他们重点改进了这种先导编辑系统的核心---逆转录酶。他们构建出一系列新的先导编辑器，每一种都是在实验室中进化而来，专门从事不同的编辑任务。他们公布了其中的被命名为PE6a至PE6g的先导编辑系统，每种系统都包含一种新的逆转录酶或Cas9变体。
这些新的先导编辑器比以前的先导编辑器效率要高出2到20倍，使得它们有可能成为更有用的治疗药物。这些作者已将 PE6 编辑器用于他们几乎所有的先导编辑项目中，对多种细胞类型进行编辑，包括动物和治疗相关的培养细胞。
Liu说，“我们非常高兴能与科学界分享这些最先进的先导编辑工具。我们希望这些新的先导编辑器能成为基因编辑领域不可或缺的一部分，毕竟基因编辑在生命科学和医学领域带来了如此多的希望和进步。”
Liu实验室研究生Jordan Doman和Smriti Pandey都是论文第一作者。他们指出这项新研究始于 2019 年夏天，当时Liu实验室甚至还没有报告首个先导编辑系统。
Doman说，“这个项目早期的重点是搞清楚这种复杂的分子机器是如何起作用的，以及它的偏好是什么。然后，我们近期致力于将这种加深的理解转化为改进的工具和潜在的疗法。”
优化每个组分
先导编辑有望校正大多数致病基因突变，但其效率会因编辑的位置、类型和被编辑细胞的类型而有很大差异。在某些情况下，只有百分之几的细胞接触到先导编辑后，最终会得到所需的基因编辑。
为了提高治疗应用的效率，Liu团队专注于研究和改进这种复杂的先导编辑系统的每个部分。Liu说，“我们之前已经优化了先导编辑系统的每一个其他组分。直到现在，我们才以一种为先导编辑量身定制的方式改进了逆转录酶。”
将 RNA 模板复制到 DNA 链的逆转录酶天然存在于所有动植物细胞和许多病毒中。但是，天然存在的逆转录酶通常会导致先导编辑效率低下，而且科学家们以前也没有报道过逆转录酶能持续提高先导编辑器的编辑效率，甚至超过原始先导编辑系统中使用的工程化逆转录酶的编辑效率。
图片来自Cell, 2023, doi:10.1016/j.cell.2023.07.039。
为了以更定向的方式优化先导编辑器的逆转录酶结构域，Liu团队转向了一种称为噬菌体辅助连续进化（phage-assisted continuous evolution, PACE）的方法，这是Liu于2011年开发的一种定向进化方法。这种方法是在实验室的“泻湖”中培养多种快速进化的噬菌体（感染细菌的病毒），并不断进行稀释。只有那些表达具有特定理想性状的基因变体的病毒才能以比稀释速度更快的复制速度存活下来。
在这项新的研究中，这些作者开发了一种 PACE 系统，该系统对噬菌体进行达尔文式的选择，使其能够进行先导编辑，以校正有缺陷的噬菌体基因。在数百个小时内，编码先导编辑器的噬菌体经历了数千代的进化，迅速产生了能更有效地进行编辑的新型逆转录酶。
Liu团队用不同类型的先导编辑任务挑战PACE系统，如插入短或长的DNA片段，然后测试存活下来的编辑器。令人惊讶的是，他们发现，进化后的先导编辑器在一项任务中（如只添加或替换几个DNA碱基）提高了编辑效率，但在其他情况下（如添加长段DNA）却表现不佳。
Liu说，“事实证明，PACE进化出的这些先导编辑器正是专门从事我们要求它们在PACE期间进行的那种编辑。但是，对一种编辑最有效的编辑器对另一种编辑却并非最有效。这一发现推翻了一种类型的先导编辑器可以最佳地执行任何类型的先导编辑的假设。”
走向治疗
随着这些作者在不同场景中测试 PACE 进化出的编辑器，他们发现了一套规则，规定了何时应该使用这七种先导编辑系统中的每一种，然后做了更多的实验来证明它们的实用性。比如，他们发现一些PE6变体可以在人类细胞系基因组的五个不同位置插入长度从38到108个碱基对不等的较长DNA片段，与目前的先导编辑器相比，编辑效率更高。这些PE6变体在对科学家们来说具有挑战性的编辑环境（如活体小鼠的大脑）中表现尤为出色。
Pandey说，“经过多年的优化，我们很高兴看到 PE6 变体扩大了先导编辑的范围。PE6变体尤其能增强对关键治疗相关位点的编辑，而这些位点使用以前的系统进行靶向编辑更具挑战性。”
在一项实验中，这些作者能够将较长的DNA序列插入到小鼠大脑皮层40%的细胞中，这比以前最先进的先导基因编辑系统提高了24倍。
Liu说，“不到2%的编辑效率和40%的编辑效率之间的差别，可能会使一些东西成为有趣的研究工具，也可能会支持潜在的治疗应用。”
这些新的先导编辑器也比以前的版本更加紧凑，使得整个先导编辑平台可以装入以前的先导编辑器难以装入的一些递送系统中。这些精简后的先导编辑器可能更容易在动物模型中使用，最终也更容易在人类患者中使用。
Liu说，“检验一项技术是否有用的真正试金石是人们是否最终采用它。我们很高兴看到 PE6 如何应用于先导编辑领域。”（生物谷 Bioon.com）
参考资料：
1. Jordan L. Doman et al. Phage-assisted evolution and protein engineering yield compact, efficient prime editors. Cell, 2023, doi:10.1016/j.cell.2023.07.039.
2. Evolved prime editors are smaller and more efficient for therapeutic applications
https://www.broadinstitute.org/news/evolved-prime-editors-are-smaller-and-more-efficient-therapeutic-applications
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