钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）是心血管疾病的第三大病因，约25%的65岁以上的老年人受到影响。虽然CAVD的病因尚不清楚，但据推测，疾病的病因是由环境和遗传因素共同作用的。目前，治疗CAVD的唯一选择是通过心脏手术进行人工瓣膜植入，包括经导管主动脉瓣置换术和外科主动脉瓣置换术。由于CAVD在多个病理阶段都有表现，因此寻找治疗方法和早期诊断具有挑战性。此外，CAVD的发展涉及一个复杂的多层组织结构，具有丰富的细胞外基质表型和独特的高度可塑性的多潜能驻留细胞群。因此，定义病理组织中存在的细胞亚群可提供对疾病病因和治疗方案的见解。
基于此，来自北京协和医院心脏大血管外科主任、协和医院器官移植中心主任董年国教授带领团队，通过使用无偏单细胞RNA测序法对从6个不同的人主动脉瓣叶分离的34632个细胞进行高通量的细胞异质性评价。通过细胞实验、原位定位和批量测序来验证正常、健康瓣膜与CAVD患者之间的差异。相关研究成果以“Cell-Type Transcriptome Atlas of Human Aortic Valves Reveal Cell Heterogeneity and Endothelial to Mesenchymal Transition Involved in Calcific Aortic Valve Disease”为题，在线发表在《Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology》 （《ATVB》）杂志上。
研究人员从样本1到6的估计细胞数量为1293、2296、6802、10126、10763和3352，使用信息主成分（n=10）的基于图的聚类将细胞分类为细胞类型组，基于图的聚类显示6个样本中有14个簇；每个簇中的细胞相对于总细胞数的比例从簇1到簇14依次减少，个体间钙化瓣膜细胞的异质性并不表明个体内存在明显的细胞簇，只有细胞数量的差异是明显的。最后选择每个簇表达量排名前100的基因定义该簇的亚型，可将14个簇归为：3个VIC，6个VDSC，1个单核细胞，1个巨噬细胞，1个淋巴细胞和2个VEC亚群。以上研究表明主动脉瓣存在细胞异质性。
研究人员基于对健康和CAVD样本的基于图的聚类比较，CAVD聚类1、2、3、4、6、8和12是显著的细胞群体。发现簇1、2、3、4、6和8是新的细胞类型，与先前确定的VEC或VIC不完全匹配。在7个群体在CAVD组中明显更多表达量排名前5的基因未能表现出显著的特异性。选择每个簇中表达量最高的基因作为识别这些显著细胞群的潜在标记（簇1为LUM，簇2为SOX4，簇3为CCL20，簇4为MT1A，簇6为RPL17，簇8为CMSS1，簇12的PI3）。且发现LUM、SOX4、CCL20、MT1A、RPL17、CMSS1在新鉴定的细胞簇中均有表达。表明新生的VDSCs参与主动脉瓣钙化。
为了证实Endo-MT是否参与了CAVD的发生，研究人员选择了IL1RL1和SELE标记定位VECs，SPARC定位VICs，IL1RL1+/SPARC+和SELE+/SPARC+细胞在CAVD标本的瓣膜内皮层边缘显著，SELE+/SPARC+细胞倾向于从内皮区迁移到间质区。内皮细胞相关的内皮标志物VE钙粘蛋白的表达水平被Endo-MT诱导显著抑制，而间充质细胞标记物COL1A和骨膜炎素的表达则被显著诱导。分离的VEC表现出鹅卵石状的形态和最小的成管能力。研究人员在使用VEC特异培养基进行原代培养的第1天，VEC显示出大量的克隆形成单位。6天后出现较大的克隆。7天后，这些细胞呈现成纤维细胞样的形态。CDH5和SELE的双重染色显示标记共定位，但仅检测到少数SELE+/CDH5−细胞。以上结果表明Endo-MT参与CAVD过程的验证及机制。
综上所述，该研究团队用无偏单细胞RNA测序法对从6个不同的人主动脉瓣叶分离的34632个细胞进行高通量的细胞异质性评价。通过细胞实验、原位定位和批量测序来验证正常、健康瓣膜与CAVD患者之间的差异。通过比较健康和CAVD标本，确定了14种细胞亚型，包括3种不均一的瓣膜间质细胞亚群，3种免疫源性细胞，2种类型的瓣膜内皮细胞，以及6种特别在CAVD小叶中发现的新的瓣膜源性间质细胞。结合主动脉瓣增厚的单细胞转录本验证主动脉瓣病变。
研究人员发现解构了主动脉瓣细胞图谱，并提示了常驻细胞亚群之间的新功能相互作用。该研究团队的研究结果可能为未来预防CAVD的靶向治疗提供了思路。
参考文献
1、Xu K, Xie S, Huang Y, et al. Cell-Type Transcriptome Atlas of Human Aortic Valves Reveal Cell Heterogeneity and Endothelial to Mesenchymal Transition Involved in Calcific Aortic Valve Disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2020 Dec;40(12):2910-2921. doi: 10.1161/ATVBAHA.120.314789. Epub 2020 Oct 22. PMID: 33086873.
2、Gee T, Farrar E, Wang Y, et al. NFκB (Nuclear Factor κ-Light-Chain Enhancer of Activated B Cells) Activity Regulates Cell-Type-Specific and Context-Specific Susceptibility to Calcification in the Aortic Valve. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2020 Mar;40(3):638-655. doi: 10.1161/ATVBAHA.119.313248. Epub 2020 Jan 2. PMID: 31893948; PMCID: PMC7388286.
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