正天丸

【摘要】  目的 探讨新正天丸对偏头痛患者血小板5-HT2A受体mRNA和粘附分子表达的影响及其相互的关系。方法 将68例患者分为2组,治疗组(35例)口服新正天丸,对照组(33例)口服氟桂嗪胶囊。利用RT-PCR技术检测偏头痛患者血小板中的5-HT2A受体mRNA,应用流式细胞仪检测偏头痛患者全血血小板膜CD41和CD62P。结果 治疗组疗效优于对照组。偏头痛患者5-HT2A受体mRNA的表达发作期与正常人有显著差异,经新正天丸治疗后可显著降低其表达。偏头痛患者发作期、间歇期血小板膜粘附分子表达均较正常人为高,而新正天丸能明显降低其表达。结论 偏头痛患者5-HT2A受体mRNA的表达和血小板膜粘附分子的表达水平均显著增强,新正天丸可能通过降低上述指标的表达抑制血小板活化,从而达到治疗目的。

【关键词】  偏头痛；5-HT2A受体；粘附分子；新正天丸

Effect of Xinzhengtian Pills on the Expression of 5-HT2A Receptor mRNA and Platelet Membrane Adhesion Molecules in Migraineurs 

　　ZHU Cheng-quan, XIE Wei, CHEN Bao-tian, et al

　　1.No.421 Hospital of PLA, Guangzhou 510318, China；2.Southern Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510515, China
   
　　Abstract：Objective To investigate changes in the expression of 5-HT2A receptor mRNA and platelet membrane adhesion molecules in migraineurs during the periods of attack and intermittence therapy by Xinzhengtian Pill (XZTP). To study the interrelation between the expression of 5-HT2A receptor mRNA and platelet membrane adhesion molecules. Methods 68 patients were randomly divided into XZTP (therapy) group and Flunarizine (control) group. The RT-PCR method and the image pattern analysis semiquantitation method were used to determine the 5-HT2A receptor mRNA expression levels in the migraineur groups and the normal control group. Flow cytometry was used to detect the expression of whole blood platelet membrane adhesion molecules in those groups. The interrelation between the expression of 5-HT2A receptor mRNA and adhesion molecules was analysed. Results The total effect have show obvious difference between therapy group and control group. 5-HT2A receptor mRNA in the attack group was higher than that of the intermittence group and the normal group, and XZTP can reduce this expression. The expression of whole blood platelet membrane adhesion molecules had a higher increase during the periods of attack and intermittence, compared with the normal control group and XZTP. The 5-HT2A receptor mRNA expression level in the migraineur groups had a high positive correlation with CD41 and moderate positive correlation with CD62P. Conclusion 5-HT2A receptor mRNA and platelet membrane adhesion molecule expression level during the period of attack was significantly augmented and platelet activation was increased. XZTP maybe restrained the expression of above indexes and resulted in platelet activation reduced.
    
　　Key words：migraine；5-HT2A receptor；platelet membrane adhesion molecules；xinzhengtian pill

    目前,国内外公认外周5-羟色胺(5-HT)主要储存在血小板中。已证实偏头痛患者血小板形态、功能和成分均不同于正常人,血小板的粘附、聚集与5-HT2A受体和粘附分子相关。因此,本研究探讨偏头痛患者血小板5-HT2A和粘附分子的表达,并观察应用新正天丸对此类表达的影响。

　　1  临床资料
    
　　偏头痛诊断按1988年国际头痛分类及诊断标准[1]。选择南方医科大学南方医院头痛专科门诊患者68例,随机分为2组(按单周应诊者为治疗组,双周应诊者为对照组)。治疗组35例,男14例,女21例；年龄15～48岁,平均(30.1±7.4)岁；病程0.5～18年,平均(9.3±4.7)年；发作期(头痛发作1天内)16例,间歇期19例；偏头痛发作以左侧为主12例,以右侧为主14例,双侧头痛9例。对照组33例,男11例,女22例；年龄15～47岁,平均(30.4±7.6)岁；病程0.5～19年,平均(9.4±4.5)年；发作期(头痛发作1 d内)14例,间歇期19例；偏头痛发作以左侧为主11例,以右侧为主12例,双侧头痛10例。健康人组选择无偏头痛发作病史的健康人15例,均系本院职工,男4例,女11例；年龄18～46岁,平均(31.7±8.3)岁；作为测定指标的正常参考值。

　　2  观察方法

　　2.1  治疗方法
    
　　治疗组服用新正天丸(组成：川芎、当归、白芍、生地黄、桃仁、红花、羌活、独活、防风、附子、细辛、麻黄、钩藤、鸡血藤、黄芪、泽泻、茯苓、生龙骨、生牡蛎)。按组成新正天丸的药物用量比例,取各药清洗后烘干,粉碎,过120目筛,混匀,用冷开水泛丸,干燥包生地黄炭衣(南方医科大学中医系制剂室制作,批号980811)。每次6 g,每日3次,温开水送服,30 d为1个疗程。对照组服用氟桂嗪胶囊(每粒5 mg,陕西西安杨森制药有限公司产品),每次10 mg,每日1次,30 d为1个疗程。治疗期间停用其它药物和疗法,戒除烟酒。

　　2.2  血小板5-HT2A及粘附分子测定

　　2.2.1  血小板5-HT2A受体mRNA的表达 

　　空腹抽取患者和健康人静脉血4 mL置于抗凝管中,以3.8%的柠檬酸钠(1∶9,V/V)抗凝,然后8 000 r/min离心10 min分离血小板。血小板残留mRNA提取参照Berry SA等[2-3]方法。RT-PCR操作方法参见试剂盒说明书。取500 ng RNA模板,加dNTP 4 μL,DTT 2.5 μL,RNA 酶抑制剂1 μL,上下游引物各1 μL,5×缓冲液l0 μL,TitanTM酶混合物l μL,去离子水补充至50 μL。50 ℃逆转录30 min。β-actin作为内对照,取500 ng总RNA模板同法逆转录扩增。取8 μL PCR产物,2%琼脂糖电泳。图像处理系统检测DNA信号灰度。5-HT2A受体与β-actin灰度之比值表示5-HT2A受体mRNA相对水平。

　　2.2.2  血小板膜粘附分子测定方法 

　　健康志愿者及偏头痛患者清晨空腹抽取静脉血3 mL,取后1 mL置硅化试管中,以3.8%的柠檬酸钠(1∶9,V/V)抗凝,取自然沉降的PRP,1～3号流式细胞仪测试管分别加入50 μL HEPES缓冲液,1号管加5 μL纯化小鼠IgG,2号管加兔抗人纤维蛋白原单克隆抗体10 μL,3号管加入抗人GMP-140单克隆抗体10 μL,然后各加入5 μL PRP,2号管和3号管分别加入0.5 U凝血酶5 μL,37 ℃温浴避光反应20 min。2号管再加rFIFC-IgG 10 μL,3号管加入mFIFC-IgG 10 μL,然后1～3号管各加入0.2%福尔马林1 mL,温浴避光反应20 min,上机检测。每个样本收集5 000个血小板,检测阳性血小板数目(fluorescence cell percentage, FC%)。

　　3  结果

　　3.1  疗效标准

    按国家中医药管理局脑病急症协作组制定的标准执行,根据治疗前后头痛指数的变化计算疗效百分数。基本恢复：治疗后观察1年,疗效百分数为90%～100%(含90%)；显效：治疗后观察0.5年,疗效百分数为55%～90%(含55%)；有效：治疗后观察0.5年,疗效百分数为20%～55%(含20%)；无效：治疗后疗效百分数20%以下。

　　3.2  2组患者偏头痛的临床疗效比较

　　(见表1)  表1  2组患者临床疗效比较[例(略)]注：与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。

　　3.3  血小板5-HT2A受体mRNA、血小板膜粘附分子CD41和CD62P表达的比较

　　(见表2)  表2 血小板5-HT2A受体mRNA、血小板膜粘附分子CD41和CD62P表达的比较(略)注：与健康人比较,*P<0.01；与发作期比较,△P<0.01；与间歇期比较,
      ▼P<0.01。
　　
　　3.4 偏头痛发作期患者血小板5-HT2A受体mRNA表达水平与血小板膜粘附分子CD41、CD62P的相关性
    
　　发作期患者5-HT2A受体mRNA表达水平与血小板膜粘附分子CD41呈高度正相关(r=0.983,P<0.01),与CD62P呈中度正相关(r=0.716,P<0.01)。

　　4 讨论
    
　　有人认为偏头痛发作时血小板释放大量的5-HT,从而引起强烈的颅外血管收缩,导致偏头痛先兆症状,随着5-HT迅速降低,引起血管扩张,导致偏头痛发作[4]。5-HT能使较大的血管收缩,血管平滑肌和成纤维细胞增殖,血小板聚集,对其它血管收缩剂、血小板聚集剂以及生长因子的作用存在放大效应[5]。5-HT的上述效应一般认为是受5-HT2A受体调节,常用于血小板活化标志的膜粘附分子为GPⅡb/Ⅲa和P-选择素(P-selectin, CD62P)。前者位于静息血小板膜表面,可反映血小板的活化状态[6]；后者位于静息血小板的α颗粒内,在静息血小板膜表面不表达,只有当血小板受激活时,α颗粒向血小板膜表面移行、融合、脱颗粒,而表达于血小板表面。因此,P-选择素被认为是最重要的反映血小板活化的指标之一[7]。
    
　　偏头痛属中医“头风病”范畴。头风病具有共同的病因病机,即多瘀、多风、多湿、多虚,其中以虚为本,风、湿为标,瘀则始终贯穿其中。我们研究发现,偏头痛患者发作期外周血血小板CD62P及血小板Fg含量显著高于正常人,显示偏头痛患者血小板活化程度增加,血小板聚集性增强,这可能在偏头痛发作中发挥重要作用[8]。而偏头痛患者5-HT2A受体mRNA的表达发作期较正常组显著增高,间歇期次之,但仍高于正常组,提示血小板5-HT2A受体局部合成和释放增加在偏头痛发病中有重要意义,表明新正天丸可明显抑制5-HT2A受体mRNA表达。此外,我们发现偏头痛患者5-HT2A受体mRNA的表达水平与血小板中CD41呈高度正相关,与CD62P呈中度正相关,提示5-HT2A受体的高表达引起血小板活化,使之聚集性增加。因此,我们认为偏头痛患者血小板活化是其发病的重要标志之一。
    
　　现代药理研究认为,新正天丸能够稳定血小板5-HT水平, 抑制血小板聚集；主药川芎中的川芎嗪可提高血小板内环磷酸腺苷(cAMP)水平,对Ca2+内流有双向调节作用,可促进血管内皮细胞分泌前列环素(PGI2),抑制血栓素(TXA2)合成酶的活性[9]；黄芪能扩张血管,调节细胞内环核苷酸浓度,并抑制血小板钙调蛋白而抑制磷酸二脂酶的活性,具有抗血小板聚集和对血小板聚集具有明显的解集作用[10]。当然,新正天丸调节偏头痛患者血小板5-HT2A受体和粘附分子表达的机制十分复杂,尚有待进一步研究阐明。

【参考文献】
  　　[1] Headache Classification Commitee of the International Headache Society. Classifcation and diagnostic criteria for headache disorders, cranial neuralgias and facial pain[J].Cephalalgia, 1988,8(Suppl7)：1.

　　[2] Collins CE, Cahill MR, Newland AC, et al. Platelets circulate in an activated state in inflammatory bowel disease[J]. Gastroenterology,1994,106(4)：840.

　　[3] Berry SA, Shah MC, Khan N, et al. Rapid agonist-induced internalization of the 5-hydroxytryptamine2A receptor occurs via the endosome pathway in vitro[J].Mol Pharmacol,1996,50(2)：306.

　　[4] Steiner TJ. Treating headache from an evidence base：the Cochrane Collaboration[J].Cephalalgia,1998,18(Suppl 21)：63.

　　[5] Miyoshi I, Kagaya A, Kohchi C, et al. Characterization of 5-HT2A receptor desensitization and the effect of cycloheximide on it in C6 cells[J].J Neural Transm,2001,108(3)：249.

　　[6] Kozubski W, Walkowiak B, Cierniewski CS, et al. Platelet fibrinogen receptors in migraine patients[J].Headache,1987,27 (8)：431.

　　[7] Harrison B, Wilbourn P, Savidge G. Expression of fibrinogen receptors in platelets of migraine patients-correlation with
GPⅡb content and plasma cholesterol-reply[J].Thromb Haemost, 1990,63(2)：318.

　　[8] 朱成全,谢 炜,陈宝田.新正天丸对偏头痛患者血小板膜粘附分子表达的影响[J].中国中西医结合杂志,2001,21(11)：822－824.

　　[9] 吴东升,陈可冀.活血化瘀复方和川芎嗪抑制血栓素A2的研究[J].中西医结合杂志,1985,5(3)：169.

　　[10] 郭云飞,葛小平,王永钧,等.黄芪仙灵脾汤加水蛭治疗肾病综合征高凝血症临床观察[J].中医杂志,1999,40(5)：281.