声 明
11月22日，Molecular Cell杂志在线发表了宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院Jeremy E. Wilusz教授为通讯作者的文章，介绍发现circRNA形成调控的新机制，杨力教授和陈玲玲教授为本文的共同作者。
研究circRNA的同行一定会注意到这个现象：同一个基因来源的linear RNA与circRNA的含量有时有相同的对应关系，有时却恰恰相反。本文作者的初衷正是希望找出决定linear RNA与circRNA相对量的机制。基于RNAi筛选，作者利用果蝇细胞中构建的Mini基因报告系统，发现了剪切体组分及转录终止相关的基因被干扰之后能显著增加circRNA的丰度，并进一步在体内和体外验证了相关的现象[1]。本文的发现为circRNA形成的调控机制提供了非常有价值的信息。
那么本文的作者是利用什么实验模型做的？怎么发现这些与circRNA形成有关的基因的？具体的结论是什么？本文的结论对circRNA形成机制的认识有什么帮助？
筛选实验用模型
作者在2015年就曾经报道果蝇中内含子反向互补序列，hnRNPs和SR蛋白在circRNA形成过程中的作用[2]。当时就用到了一种构建的Laccase2基因2号外显子的mini基因报告系统。本文在原有的报告载体基础上在上下游分别增加了外显子1 和外显子3。该报告载体用pMT启动子，可以通过在培养体系中添加CuSO4诱导基因的转录。如果是常规的RNA剪切，会形成外显子1,2,3依次连接的linear RNA产物，但由于外显子2两侧存在反向互补序列，可单独形成外显子2来源的circRNA，此外，该报告载体的终产物中还有一小部分外显子1和3直接连接的产物。作者通过Northern杂交的方法进行各种转录后产物的相对含量分析。
图1 基于果蝇Laccase2的 mini基因报告系统 （来自[1]）
为方便研究，作者基于抗性标记（潮霉素抗性），在果蝇DL-1细胞中获得了可诱导表达的Laccase2的 mini基因报告系统的稳定株。首先分析了该报告系统生成的linear RNA和circRNA的稳定性情况。CuSO4诱导后1小时，linear RNA产物就开始明显增加，而circRNA生成的速度明显慢很多。另一方面，为探明两种形式的RNA分子的稳定性，作者还分析了它们的半衰期，首先脉冲诱导3小时，然后用BCS（bathocuproine disulphonate，一种RNA合成的抑制剂）处理，看两种类型的RNA分子存在时间的长短。结果表明linear RNA半衰期较短，大约2小时左右，而circRNA半衰期甚至大于24小时。这些数据初步说明linear RNA和circRNA在生成速度，稳定性方面有非常大的差别，linear RNA的生成速度和降解速度都明显快于circRNA。
图2 linear RNA和circRNA生成速度与稳定性分析 （来自[1]，排列略有改动）
如何通过RNAi筛选出调控circRNA形成作用的因子的？
剪切体相关因子如何筛选到的？
有文献报道果蝇中干扰SF3b1 (CG2807) 或 SF3a1 (CG16941)后，内源Laccase2基因的linear RNA产物会有所减少[3]。作者于是分析了干扰这两个基因后两种RNA的含量变化情况，circRNA居然增加了！那么其它的SF3b和SF3a的亚基会是怎样的情况？作者进一步分析了SF3b1~6及SF3a1~3的情况，全部都发现干扰后circRNA相对升高！但不同的亚基干扰实验中，linear RNA与circRNA的总量会有较大的波动，但两者的相对变化趋势是一致的，都是circRNA增多，linear RNA减少。
图3 干扰SF3b和SF3a的亚基能显著提高circRNA表达量 （来自[1]）
SF3b和SF3a的亚基对内源基因的影响如何？
上面是报告基因得到的结果，这一干扰过程对内源性的基因表达会是什么影响呢？作者于是分析了果蝇细胞中内源Laccase2基因的linear RNA和circRNA的表达情况，QPCR和Northern实验均表明，干扰上述的SF3b或SF3a的10种亚基均可显著降低linear RNA的表达量，同时增加circRNA的表达量。
图4干扰SF3b和SF3a的亚基能显著提高内源Laccase2基因circRNA表达量 （来自[1]）
除了内源性Laccase2基因，在另外两种内源基因Uex和Plex基因上也发现了相同的变化趋势，说明这种变化不是报告基因载体或Laccase2基因特异性的现象。
图5干扰SF3b和SF3a的亚基能显著提高内源基因circRNA表达量 （来自[1]）
Plad B是一种已知的可结合并抑制SF3b的化合物，具有抗肿瘤活性。作者用Plad B处理后发现同样会导致linear RNA下降，circRNA上升。这些实验数据表明干扰或抑制U2 RNP的组分，能明显降低linear RNA的生成，但可促进circRNA的生成，说明linear RNA形成过程对抑制U2 RNP的处理更敏感。
图6 SF3b抑制剂降低linear RNA表达但增加circRNA的表达 （来自[1]）
其他剪切体的亚基是否也有类似的作用？
上面探讨的几个亚基都属于U2 RNP的组分，剪切体是一个庞大的动态复合物结构，其它的剪切体组分是否也有类似的现象？作者于是针对剪切体的各种组分展开了探索分析，选择了内源性Plex基因，原因是这个基因在上面的实验中变化趋势最明显。共分析了35种亚基的情况，结果表明有25种亚基干扰后circRNA的相对含量上升超过两倍，很多的亚基甚至超过了10倍的变化，这些变化极显著的组分包括：snRNPU1-70K、snRNP-U1-C、Prp8、Slu7和CG6015（CDC40）。这表明剪切体的很多核心组分的含量改变后能显著提高circRNA的生成，抑制linear RNA的生成。除了Plex基因，作者也探索了这些剪切体组分对其他内源基因的影响，包括Laccase2，Uex，minibrain (mnb)，CG42663，Ect4。
图7 部分剪切体亚基干扰后显著增加circRNA生成 （来自[1]）
转录终止相关因子是如何筛选到的？
本文作者除了剪切体，还探索了转录终止相关的因子对linear RNA和circRNA相对含量影响的情况。因为很多的研究表明circRNA的形成往往是聚合酶II转录完成后进行的，因此作者就设想，转录终止作用会不会与circRNA的形成有关系？于是作者首先针对转录终止过程中的内切核酸酶Cpsf73开始分析。结果发现干扰Cpsf73后，circRNA的表达升高了2倍左右。但奇怪的是即使将mini报告基因载体中的SV40 polyA元件替换成能自动切割的锤头状核酶元件HhRz，干扰Cpsf73后依然会提高circRNA的含量。更奇怪的是，即使不加诱导剂的情况下，干扰Cpsf73依然会提高circRNA的含量！
图8 转录终止因子参与circRNA形成过程（来自[1]）
为什么会出现不加诱导剂也能表达报告基因？
这不太可能是简单的渗漏表达，因为空白对照组是没有表达的。一定存在另一个可以启动mini报告基因表达的启动子，作者于是将mini报告基因替换成另一个基因，dati，该基因可以不借助内含子的反向互补序列而形成circRNA产物。置换后同样会发现dati基因在不加诱导剂的情况下干扰Cpsf73后也可以表达。在这个载体的上游有一个LTR启动子，用于表达抗性基因HygroR，会不会是这个启动子后面不终止了，导致通读，然后转录出了mini报告基因的产物？作者经过进一步的实验表明确实是这样的情况。在Northern杂交的结果中也能看到通读造成的融合形式的转录产物。
图9 干扰Cpsf73后出现转录通读 （来自[1]）
转录通读作用如何证明的？
与直接启动mini报告基因启动子的情况有些不一样，这种通读作用产生的mini报告基因产物中circRNA形式的产物明显更多。转录终止作用的模型中，Cpsf73作用之后会引入Rat1外切酶（5’→ 3’）的作用位点，Rat1将后面的RNA降解掉，形成完整的转录产物，实现转录终止。干扰Rat1后，linear RNA形式的融合产物变少。干扰另一种转录终止相关的因子Symp，也有与Cpsf73类似的情况。为进一步证实转录通读的现象，作者将mini报告基因进行了改造，Laccase2基因置换成eGFP，转录终止元件置换成HhRz，为保护转录产物不被进一步降解，HhRz前面增加了NSs元件。结果证明转录通读的情况确实会在干扰Cpsf73后产生。
图10干扰转录终止因子促进下游circRNA形成 （来自[1]）
转录通读作用在人类的细胞是否也会影响circRNA的形成？
在人的PA1细胞中用DRB处理，然后脉冲标记4sU，以准确的鉴定新生RNA。基于共表达特征分析，作者筛选出39种可能存在转录通读的基因对。挑选了MATR3和 PAIP2作为研究对象进行分析，PAIP2位于下游，且与MATR3是同一个方向的基因。PAIP2有一种外显子2和3形成的circRNA（circ PAIP2）。作者在这个模型中分别干扰了CPSF3(CPSF73)和CPSF4 (CPSF30)，表明可明显增加两种基因中间的衔接区的RNA产量，说明存在转录通读的情况。与此同时，circPAIP2的含量也随之升高，说明人类细胞中也存在与果蝇模型中类似的转录通读作用及下游基因circRNA表达增高的现象。进一步，利用翻译核苷酸（ASO）对通读产物进行干扰，有效率达80%，与此同时，下游的circPAIP2也随之减少，说明这种条件下circPAIP2是由转录通读造成的。
图11 人类细胞中也存在转录通读促进下游基因circRNA生成的情况 （来自[1]）
到此，本文的故事就结束了。本文为circRNA的形成作用提供了非常好的研究思路，也大大提高了我们对circRNA形成作用的理解和认识。
人类基因组中超过75%的区域能在转录组研究中发现，其中很大一部分是非编码区的，这里面有没有类似转录通读的作用导致的？与此对应的，circRNA的表达量是否也是基因之间类似转录通读这样的作用过程造成的？本文还提示linear RNA与circRNA的生成过程对剪切体的活性状态敏感性有较大差别，circRNA似乎更“耐受”剪切体状态不佳的情形，对应于疾病，应激，环境压力等胁迫条件下，剪切体活性的一些细微改变是否能系统影响linear RNA和circRNA的表达平衡状态？这篇文章虽然只是报道了两个有趣的发现，在机制方面并未深入探索，但这些有趣的现象为探究circRNA形成机制及circRNA与linear RNA相互关系的问题打开了一扇窗户。
参考文献：
1. Dongming Liang, D.C.T., Zheng Luo, Huang Wu, Li Yang, Ling-Ling Chen, Sara Cherry and Jeremy E. Wilusz, The Output of Protein-Coding Genes Shifts to Circular RNAs When the Pre-mRNA Processing Machinery Is Limiting. Molecular Cell, 2017.
2. Kramer, M.C., et al., Combinatorial control of Drosophila circular RNA expression by intronic repeats, hnRNPs, and SR proteins. Genes Dev, 2015. 29(20): p. 2168-82.
3. Wahl, M.C., C.L. Will, and R. Luhrmann, The spliceosome: design principles of a dynamic RNP machine. Cell, 2009. 136(4): p. 701-18.
联系客服
