普丹战争后，为了把奥地利这一德意志统一运动的大阻碍解除掉，普鲁士酝酿了一场更大的阴谋。1866年，普鲁士借口独占石勒苏益格一荷尔斯泰因地区，挑起了奥地利的不满。作为德意志地区的两大强国，奥地利和普鲁士互看不顺眼，早就想打一架了，一点小火花就可以引起两国的擦枪走火。
经过添油加醋，此事愈演愈烈，双方拉开了阵势准备干一架了，双方的盟友也泾渭分明。站在普鲁士一方的，有梅伦堡、奥尔登堡和北德意志的其他各邦，以及汉堡、不来梅和吕贝克3个自由市。站在奥地利一方的，有萨克森、汉诺威、巴伐利亚、巴登、符腾堡、黑森一加塞尔、黑森一达姆施塔德和德意志邦联的其他成员国。从大邦国的数量和人口、面积来说，奥地利方面占有优势，但是，从军事实力来说，普鲁士则显然强于对方。对于奥地利更揪心的是，意大利站在普鲁士一方，企图收复被奥地利占领的威尼斯地区。
1866年6月，双方战争爆发了。这场战争持续了七星期，所以此次普奥战争又被称作“七星期战争”，奥地利不出意外的战败了。7月，由于奥地利皇帝弗兰茨·约瑟夫的请求，法国皇帝拿破仑三世出面调停。当时，普军是有能力继续进攻的，被胜利冲昏了头脑的普王威廉和他的将领们，都要求继续进军，攻占维也纳，彻底击溃奥地利。然而，头脑清醒的俾斯麦却有政治远见，他担心战争一旦拖延，将引起法国的干涉，或者在被击溃的奥地利境内发生大规模的反抗革命，从而使普鲁士统一德国的计划毁于一旦，因而力主谈和。
俾斯麦认为，如果过分地伤害奥地利人的感情，迫使他们孤注一掷，甚至铤而走险，那么，在未来必将来临的普法战争中，将不能争得奥地利的中立，对普鲁士很是不利。因此，他力排众议，主张立即缔约，甚至对国王以辞职相威胁。普王威廉一世在权衡利弊之后，终于让步。7月22日，普奥双方正式签署协议停战。
协议规定：德意志联邦议会解散，奥地利完全退出旧的德意志联邦。而普鲁士则有权建立以它为首的北德意志联邦；奥地利把它对石勒苏益格一荷尔斯泰因的管理权全部让给普鲁士，并向普鲁士偿付一笔大的赔款；同时，奥地利还把威尼斯割让给意大利。这一仗，奥地利损兵折将，割让领土，元气大伤。普鲁士则统一了北德意志，基本上达到了先前的作战目的，但没要奥地利的赔款，给奥地利留了日后结盟相处的空间，而且在接下来的普法战争中，奥地利也保持了中立。
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