ERKl/2和p38MAPK在介导CGRP和Ang II诱导血管平滑肌细胞Noxl表达中的作用
张晓一1，于潇华2，刘玉环2，杨丽2，王珍2，阳芳2，秦旭平2，曾泗宇31长治医学院药学系药理教研室，长治046000，山西；
2南华大学药物药理研究所血管生物学实验室，衡阳421001，湖南；
3广东省第二人民医院药物临床试验基地，广州510317，广东
【摘要】目的：探讨胞外信号调节激酶1/2( ERKl/2)和p38丝裂原激活蛋白激酶(p38MAPK)在降钙素基因相关肽( CGRP)和血管紧张素II( Angn)诱导血管平滑肌细胞NADPH氧化酶．1( Noxl)表达中的作用。方法：体外培养鼠源性A10血管平滑肌细胞株(A10VSMC)，用Ang II或／和CGRP作为处理因素，MTT法检测细胞增殖活力；流式细胞术检测细胞周期分布；Westernblot检测ERKl/2和p38MAPK总蛋白和磷酸化蛋白以及Noxl蛋白的表达水平。结果：与对照组和CGRP组相比，Ang II在诱导A10VSMC活力和增殖的同时，亦能增加磷酸化ERKl/2和p38MAPK信号激酶和Noxl的表达。CGRP预孵育细胞30 min却能显著抑制Ang II诱导的细胞增殖活力、Noxl蛋白、磷酸化ERKl/2和p38MAPK的表达；二苯基碘(DPI)能抑制Ang II诱导的细胞增殖、磷酸化p38MAPK及Noxl表达，但不能抑制Ang II诱导的ERKl/2磷酸化。p38MAPK阻断剂SB203580不但能抵消Ang II诱导的Noxl表达作用，而且能协同CGRP抑制AngII诱导的Noxl表达。而ERKl/2阻断剂PD98059对CGRP和／或Ang II诱导Noxl表达作用的影响无统计学意义。结论：Ang II诱导A10VSMC增殖与激活Noxl有关，CGRP抑制AngII诱导的Noxl表达，可能主要通过抑制p38MAPK信号途径发挥作用，而与ERKl/2信号途径无显著关系。
【关键词】血管紧张素II；降钙素基因相关肽；血管平滑肌细胞；NADPH氧化酶；丝裂原激活蛋白激酶
氧化应激在心血管病的发生发展中起重要作用。目前认为氧化应激产生的活性氧( ROS)是导致心血管疾病发生的病理因素，而在生理状态下，ROS也是心血管细胞的重要信号分子。血管平滑肌细胞(VSMC)异常增殖在血管增殖性疾病如高血压、动脉粥样硬化、肺动脉高压等疾病的发生、发展和预后中起重要作用。在外源性致病因素的作用下，体内产生过量的血管紧张素II (AngII)[1]、凝血酶[2]和血小板源性生长因子( PDGF)[3]等都能够使VSMC产生过量的ROS，进而诱导激活p38MAPK[4]、Akt[5]、胞外信号调节激酶1/2( ERKl/2)[6]等信号激酶，进一步加重VSMC增殖。
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸( NADPH)氧化酶( Nox)在非吞噬细胞存在多个亚型，包括Noxl、Nox2、Nox3、Nox4、Nox5、DUoxl、DUox2等。在血管平滑肌细胞中，Noxl被认为是ROS来源的主要催化酶[7]。研究表明，Ang II能够上调Noxl的表达，Noxl通过介导VSMC迁移、增殖，在新生内膜的形成中发挥重要的作用[8]。转染Noxl的反义序列能够抑制Ang II诱导超氧化物产生的早期阶段，并且能够显著降低Ang II诱导的氧化还原作用敏感的p38MAPK和Akt激酶的活化，但是对ERKl/2的影响不大[9]。由于ERKl/2和p38MAPK途径在介导Ang II促进VSMC增殖中起重要作用[IO-II]，且前期研究证实，一定浓度的降钙素基因相关肽( CGRP)在抑制Ang II诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖的同时，也抑制磷酸化ERKl/2的表达[12]。那么，CGRP对Ang II诱导的VSMC增殖的抑制作用是否涉及Noxl活性的变化，以及其信号通路是否涉及到ERKl/2和p38MAPK途径尚有待探明。本研究拟利用鼠源性A10血管平滑肌细胞株(A10VSMC)，在观察CGRP对Ang II诱导的VSMC增殖的抑制作用同时，探讨ERKl/2和p38MAPK信号对Noxl表达的影响，从而进一步揭示CGRP对Ang II诱导的平滑肌细胞增殖抑制的作用机制，为阐明CGRP在保护心血管机制方面提供新思路，也可望为新药研制提供新靶点。
1 材料与方法
1.1 实验材料及试剂
A10VSMC购于ATCC公司；Ang II、CGRP、CGRP8 -37、PD98095 和SB203580均购于Sigma公司；MTT购于美国Am-resco Inc.公司，二苯基碘(DPI)购于东京化成工业株式会社，ERKl/2及p-ERKl/2、p38MAPK及p-pMAPK抗体均为Cell Signaling Technology产品，Noxl抗体购于Abcam公司。其余缓冲液试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器
C02培养箱USA Thermo ElectronCorporation公司产品；AlphalmagerTM 2200凝胶成像系统为USA Alpha Innotech Corporation公司产品；Pure Maxima LS纯水器为UK ELGA Ltd.公司产品；聚丙烯酰胺电泳及转膜系统购于USA Bio-Rad Laboratories，Inc.公司。
1.3 细胞培养与处理
将A10VSMC加入含10%胎牛血清(FBS)的DMEM完全培养基中，置于37℃、5% C02的培养箱中培养。待细胞长80%左右后进行传代培养。A10VSMC用0.1%FBS同步化24 h后，按实验要求加入处理因素。本实验的处理因素的终浓度通过参考本实验前面工作和其他报道[12-13，并根据本研究预实验结果做适当调整，培养液中的浓度分别为：CGRP 100nmol/L, CGRP8 -37 50 nmol/L, Ang 11 100 nmol/L,DPI 20 μmol/L, PD98095 20 μmol/L, SB203580 20μmol/L。
1.4 MTT法检测细胞活力
A10VSMC同步化后，分组为：①Control组；②Ang II组；③CGRP+ Ang II组；④CGRP组；⑤DPI+Ang II组；⑥DPI+CGRP+Ang II组。按分组要求给予不同处理因素后，每孔加入浓度为5g/L MTT10μL，继续培养4h后终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μL DMSO，室温振摇混匀10nun，待紫色结晶完全溶解后，用酶联免疫仪在波长570 nm处读取吸光度(OD)。通过与对照组值相比得到处理组的光密度，推测细胞增殖情况，实验重复3次。
1.5 流式细胞术检测细胞周期分布
分组同前，经过处理后的A10VSMC，离心沉淀后用0.3 mL含10% FBS的PBS悬浮，移入1.5 mL EP管中，加入0.7 mL无水乙醇，置- 20℃下固定细胞24 h以上。3 000 r/min，离心30 s，吸弃上清，用1 mLPBS重悬细胞，再离心洗涤细胞一次，吸弃上清，沉淀细胞用100 μL浓度为1mg/mL RNase A悬浮，37℃放置30 min，再加入浓度为50 μg/mL的PI 400 μL，置暗处10 min后上机检测Go/Gl、S、G2/M各期细胞的百分比，按公式“增殖率( RP) =(S+G2/M)/( Go/Gi+S+G2/M)×100%”计算细胞增殖率。
1.6 Western blot法检测蛋白
按照试剂盒步骤分别提取细胞核、细胞浆、细胞膜结构蛋白。用BCA试剂盒进行蛋白定量。将提取的细胞蛋白质样品（40 μL总蛋白量／泳道）加入上样缓冲液，100℃煮沸5~ 10 min，在SDS-PAGE( 12%)凝胶上进行电泳分离，置电解缓冲液中，5%积层胶100 V电泳约20—30 min，待样品进入分离胶后，改为150 V继续电泳，当溴酚蓝指示剂离分离胶底线时停止电泳。100 V湿转至PVDF膜上120mino TBST (50 mmol/L pH 7.6Tris.Cl, 150 mmol/L NaCl，0.1% Tween 20）配制的5%脱脂牛奶室温摇床封闭1 h，加入一抗（Noxl效价为1：200; ERKl/2为1:1 000 - p-ERKl/2为1:1_OOO;p-p38MAPK为1:1 000;p38MAPK为1:1 000;B-ac-tin为1：1 000)4℃孵育过夜，TBST洗膜3次（每次10 min）后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（效价为1:1 000）或兔抗山羊二抗（1:1 000)，室温下摇床孵育45 min，TBST洗膜3次（每次15 min），暗室中由[发光剂A、B混液各200μL于PVDF膜上激发荧光后压片30 min后显影、定影，洗片晾干后，用灰度扫描分析。
1.7 统计学处理
所有数据均采用均数±标准差（±s）表示，采用SPSS 14.0软件进行数据统计分析，多组间差异比较用单因素方差分析( ANO-VA)检验，组间比较用τ检验，P<>
2 结果
2.1 CGRP或/和DPI对AngII诱导A10VSMC增殖的抑制作用
细胞的增殖分别用细胞话性(ng．1)和细胞增殖周期(Fig. 2.、Tab.1)间接表示- A10VsMC用0.l%FBS同步化24 h后，加^相应的预处理因素C GRP( 100 nmol/L，30 min)、DPI(20 μunol/L，30 min)；处理因素AngⅡ(100 nmol/L，24 h)。结果显示，AngⅡ可显著增加VSMC的活力和增殖，分别用CGRP或／和抗氧化剂DPI预处理细胞30 min，A10VSMC的活力（Fig．1）和细胞增殖率( Tab．1)明显降低(P<0.>
2.2 CGRP或/和DPI对AngII诱导Noxl表选的抑制作用
为了验证AngⅡ引起的细胞增殖是否与氧化应激相关，我们用抗氧化剂DPI预处理细胞在加处理因素，观察Noxl的表达情况。从Fig.3中可以看出，与Control组相比，Ang II能够显著刺激Noxl的表达，CGRP和／或DPI预孵育细胞30 min均能显著降低Ang II诱导Noxl表达的作用，提示Ang II引起的A10VSMC增殖与诱导Noxl的表达有关，CGRP对Ang II诱导的血管平滑肌细胞增殖的抑制作用与抑制Noxl的表达有关。
2.3 DPI或/和CGRP对AngII诱导的p-p38MAPK和pERKL/2的表达影响
为了验证CGRP或/和抗氧化剂DPI对信号蛋白p38MAPK和ERKl/2活性的影响，用DPI或CGRP分别或共同处理细胞30 min，再给予AngⅡ处理细胞，结果如Fig.4所示。DPI或CGRP都能够分别和协同抑制AngⅡ诱导的p38MAPK磷酸化(Fig.4A)；对ERKl/2而言，CGRP能够抑制ERKl/2磷酸化，但DPI对ERKl/2磷酸化的影响不具有统计学差异(Fig. 4B)。结果提示，氧化应激介导AngⅡ激活p38MAPK信号通路，但对AngⅡ激活ERKl/2信号通路无影响；CGRP对AngⅡ诱导的A10VSMC增殖与抑制p38MAPK和ERKl/2信号的活化均有关。
2.4 p38MAPK或ERKL/2激活对AngII诱导Noxl表达的变化
为了验证ERKl/2和p38MAPK信号通路对CGRP抑制Ang II诱导Noxl表达的变化的作用是否相同，以CGRP受体阻断剂（CGRP8-37）为对照剂，分别加入激活ERKl/2和p38MAPK信号蛋白的阻断剂，从图中可以发现，ERKl/2阻断剂PD98059对Ang II诱导的Noxl表达影响不大，但阻断ERKl/2也能增强CGRP抑制Ang II诱导的Noxl表达，说明ERKl/2通路介导Ang II激活Noxl的表达方面也发挥一定作用(Fig. 5A)。然而p38MAPK的阻断剂SB203580既能够降低Ang II诱导的Noxl的表达，也能协同增强CGRP降低Noxl表达的作用(Fig. 5B)。提示Ang II诱导早期ROS产生是激活p38MAPK主要因素而与ERKl/2激活关系不大。在后期大量产生ROS时，CGRP通过p38MAPK通路降低Noxl的表达在抑制Ang II诱导的VSMC增殖中发挥重要作用。
3 讨论
经典的丝裂原活化蛋白激酶( MAPKs)包括ERKl/2、p38、c-Jun、JNK( N-terminal kinases)和ERK5，是细胞内重要的信号传导系统之一，在心血管疾病的发生和发展中有重要意义。其中，ERKl/2和ERK5与细胞增殖有关，而JNK和p38更多与应激反应相关，如氧化应激、高渗透和放射等[14]。Ang II增加引起的VSMC增殖是心血管疾病如高血压、动脉粥样硬化等病理性血管重构的重要病理因素，但其机制尚不完全清楚。MAPKs信号激酶各成员在介导Ang II诱导的VSMC增殖中所起作用各不相[13-14]，如用Nox的非特异性抑制剂DPI处理之后，不能抑制Ang II诱导的ERKl/2的激活，但可以抑制AngII诱导的JNK和p38MAPK的激活降低ROS的过量生成[13]。这说明Ang II诱导的VSMC增殖机制除通过JNK和p38MAPK介导的氧化应激途径外，还通过其他途径如PKC和ERKl/2等[15]。前期工作表明，CGRP通过抑制p38MAPK／Nox4通路保护氧化应激诱导的血管内皮细胞损伤[16]，也能通过抑制ERKl/2抑制体外培养的VSMC增殖[17]。由于Noxl主要在VSMC中表达，是该类细胞产生活性氧的主要来源[18-19]。故本研究进一步探讨p38MAPK和ERKl/2在介导CGRP抑制Ang II诱导的VSMC增殖和Noxl表达中的作用对阐明CGRP的血管保护机制有重要意义。
本实验发现，在Ang II诱导下，细胞早期通过产生活性氧介导了p38MAPK激活，但是对ERKl/2激活的影响不大。给予DPI预处理能减弱Ang II诱导的A10VSMC的增殖，这也说明生理状态下ROS是细胞信号转导的重要参与者，激活的p38MAPK是进一步激活Noxl产生过量ROS的主要途径。过多的ROS损伤细胞的脂质、DNA和蛋白质，破坏细胞的正常功能是导致A10VSMC表型转化和增殖重要因素。同时，我们发现CGRP可抑制Ang II诱导的Noxl的高表达。加入ERKl/2阻断剂PD98059对Ang II诱导的Noxl表达无显著性影响，然而加入p38MAPK的抑制剂SB203580，却能显著降低Noxl表达。这也说明激活p38MAPK是病理剂量级ROS产生的主要途径。不可否认MAPKs的其他成员如JNK激活也可能在ROS产生中扮演重要角色[20]。
综上所述，本实验进一步验证了Ang II诱导VSMC增殖机制与MAPKs信号通路有关，p38MAPK和ERKl/2磷酸化在介导细胞增殖中所起的作用不同，CGRP通过抑制p38MAPK通路抑制Ang II诱导Noxl高表达是其抗氧化应激保护血管的主要途径。
参考文献【略】
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