钟树志1，裴东1，晁杲1，周静1，洪宗元2
1皖南医学院组胚教研室，芜湖 241002，安徽；2皖南医学院药理学教研室，芜湖 241002，安徽
国家自然科学基金面上项目(81671318)；安徽省科技攻关项目(1501041157)；安徽省自然科学基金项目（1608085MH211）
钟树志，男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：神经退行性疾病与中药防治。
Tel: 0553-3932468
E-mail: zhongshuzhi2006@163.com
裴东，共同第一作者，男，研究生，研究方向：神经损伤与中医防治。
Tel: 05533932468
E-mail: 879134918@ qq.com
洪宗元，通信作者，男，博士，教授，研究方向：神经药理。
Tel: 86-553-3932003
E-mail: zyhongwnmc@aliyun.com
摘要 目的：研究大鼠坐骨神经离断吻合术后，复元活血汤对其修复的影响，并探讨其可能机制。方法：将60只SD大鼠实施右侧坐骨神经离断吻合术，术后大鼠随机分为复元活血汤给药组、甲钴胺给药组和模型组，每组20只。复元活血汤组给予复元活血汤，按9 g·kg-1·d-1灌胃；甲钴胺组给予甲钴胺，按6.25´10-4 g·kg-1·d-1 灌胃；模型组按复元活血汤的溶液剂量，给予等量溶剂灌胃；灌胃2~8周。假手术组大鼠20只，暴露右侧坐骨神经后，不做任何处理缝合切口。给药3 d后，ELISA法检测大鼠血清中IL-1β和TNF-α含量，给药2周后，RT-PCR法检测吻合口近、远端2 cm 神经组织的IL-1β和TNF-α mRNA 的表达，Western blot法检测p-Src、p-Erk1/2蛋白的表达；分别于给药2周、4周、8周后，检测大鼠坐骨神经功能指数；于给药8周后，观察坐骨神经和其支配肌肉的病理学改变。结果：与模型组比较，复元活血汤组和甲钴胺组大鼠坐骨神经功能指数显著改善，神经纤维生长良好，腓肠肌肌纤维直径和截面积显著改善，复元活血汤组大鼠血清中IL-1β和TNF-α含量显著降低，吻合口神经组织的IL-1β和TNF-α mRNA 的表达显著减少，p-Src、p-Erk1/2蛋白表达显著降低（P<>结论：复元活血汤可通过减轻大鼠损伤坐骨神经吻合口炎症反应，抑制Src、Erk的磷酸化，促进神经的修复。
关键词： 复元活血汤；坐骨神经离断吻合；炎症反应；磷酸化Src；磷酸化细胞外信号调节激酶
周围神经离断性损伤是临床常见的神经损伤。损伤后的再生修复，因机制复杂、过程漫长，涉及肢体感觉和运动功能的恢复，一直是神经科学研究的重要内容。周围神经损伤后，其远端轴突发生瓦勒氏变性，而其近端轴突断端在施万细胞形成轴突鞘的基础上，以出芽方式向远端延伸，取代发生变性消失的远端轴突，恢复与其支配器官的功能联系。施万细胞一方面形成轴突鞘，另一方面还分泌神经营养因子，促进轴突的延伸，因而，改善施万细胞生存的微环境，为其提供足够的营养支持至关重要。当前，促进神经修复的药物主要是神经营养因子，但因其半衰期短，长期大量使用会带来副作用，因此，寻找新的、有效的、且毒副作用小的药物显得尤为必要。
“复元活血汤”出自金朝李杲编撰的《医学发明》，有“活血祛瘀、疏肝通络”之功效，用以治疗“跌打损伤、瘀血阻滞证、胁肋瘀肿、痛不可忍”之症。在治疗骨损伤（骨折）时，中医认为“血不活则骨不能接”，因而“复元活血汤”又被用于治疗骨折，且疗效显著[1- 2]；进一步研究表明，复元活血汤可以通过缓解炎症反应，促进血肿吸收，改善疼痛，提高骨折后手术疗效[3]。对于坐骨神经损伤，“复元活血汤”是否能通过减轻炎症反应，改善局部施万细胞生活的微环境，起到促进神经修复的作用呢？目前在这方面尚缺乏系统研究。本实验拟对SD大鼠坐骨神经实施离断吻合术后，给予“复元活血汤”治疗，考察大鼠神经功能的恢复，探讨其可能机制。
1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠80只，体重（195±15） g，4周龄，购自安徽省实验动物中心 (实验动物许可证号：SCXK (皖) 2011-002)。自由饮水进食，环境温度控制在 (22 ± 2) ℃，湿度 (65±5) %，术前禁食12 h。实验动物喂养与使用遵守实验动物学会《实验动物饲养与管理指南》之规定。
1.2 药物、主要试剂及仪器 复元活血汤（柴胡15 g，天花粉9 g，当归9 g，红花6 g，桃仁9 g，酒大黄30 g，炮甲片6 g另煎，甘草6 g），购自芜湖市中医院中药房。除炮甲片外，将其他7味药材按方比例常规煎煮，滤取药液，重复3次，炮甲片捣粉后用同样方法煮沸，滤取药液，合并药液，至冷冻干燥机-40 ℃制成冻干粉，每方90 g可得冻干粉18 g左右，-20 ℃冰箱保存备用。甲钴胺片（批号1407033，卫才(中国)药业有限公司），购自芜湖市元初大药房；GAPDH 抗体（批号400-31），购自美国CST生物有限公司；anti-Src (批号 4034)、anti-p-Src (批号 4037)、anti-Erk1/2 (批号 2045)、anti-p-Erk1/2 （批号 2042）均购自美国Santa Cruz 公司；IL-1β ILISA试剂盒（批号 15202165114）和TNF-α ILISA试剂盒（批号15202165114）均购自南京道萨生物科技发展有限公司（道萨，南京）； PCR 引物由上海生工生物技术有限公司合成（Sangon，上海）。SXP-1c手术显微镜（上海医疗器械仪器厂，上海）；FD-1B-80冰冻干燥机（上海仙象仪器仪表有限公司）；-80 ℃冰箱（Thermo，美国）；显微手术器械（上海金钟，上海）；低温高速离心机（Thermo，美国）；荧光化学发光凝胶成像分析仪（Biorad，美国）。
1.3 动物造模、分组与给药 取雄性SD大鼠60只，10 % 水合氯醛腹腔注射麻醉，将大鼠俯卧位固定于解剖台上，备皮，铺无菌巾，消毒，于大鼠右大腿股后外侧皮肤作1.0 cm纵向切口，暴露并钝性分离肌肉，暴露、分离坐骨神经，体视显微镜下，在距梨状肌下缘约0.5 cm处，将坐骨神经横行剪断后，9-0丝线行神经外膜吻合术，缝合4针，确保断端之间无张力、无扭转、保持1 mm距离，4-0丝线缝合肌肉和皮肤；另取SD大鼠20只作为假手术组，麻醉、固定、消毒等措施同前，仅暴露坐骨神经，不做神经离断吻合术，缝合肌肉和皮肤同前。大鼠术后安静饲养，肌注青霉素（10万单位/天）抗感染，连续3 d，自由饮水进食。
术后第2天起，行坐骨神经离断吻合术大鼠随机分为三组，每组20只。复元活血汤组按1.8 g·kg-1·d-1（相当于生药量9 g·kg-1·d-1，相当于临床剂量1.44 g·kg-1·d-1，折合为60 kg成人剂量，约为86 g/d剂量灌胃复元活血汤冻干粉0.5％羧甲基纤维素钠混悬液；甲钴胺组按6.25×104 g·kg-1·d-1 剂量灌胃甲钴胺0.5％羧甲基纤维素钠混悬液；模型组每日给予等量溶剂灌胃；假手术组不作其他处理。
1.4坐骨神经功能指数（Sciatic function index SFI）检测 在术后2周、4周、8周行SFI检测：将白纸铺于塑料槽(长×宽×高: 60×10×15 cm)内，大鼠后足跟涂敷无毒染料后，置于槽一端，使其自行通过塑料槽，槽内白纸上留下足迹。检测前将大鼠适应性训练2 d。测量内容包括：足印长度（PL，从足尖到足跟的距离）；足趾宽度（TS，第1趾至第 5趾的距离）；中间足趾宽度（IT，第2趾到第4趾的距离）。结果由一人测量（精确到0.1 mm）。SFI计算公式如下[4]：
NPL、NTS 和 NIT 分别为健侧后肢的PL、TS和IT 值；EPL、ETS和EIT分别为术侧的PL、TS和IT值。SFI值为-100~0之间，绝对值越小，功能恢复得越好。
1.5血清炎症因子的检测 给药3 d后，尾静脉取血，室温静置约1 h 后，3 500 r/min离心 10 min，取上清置-70 ℃冻存待测。IL-1β和TNF-α用酶联免疫吸附法（ILISA法）检测，严格按试剂盒说明操作。
1.6总RNA的提取 大鼠给药2周，坐骨神经功能指数检测完毕后，每组随机取10只大鼠处死，取神经吻合口上、下各1 cm 神经组织，剪碎，部分组织放入加有 1 mLTrizol 的冰浴匀浆。其余按TOYABO 公司试剂盒操作提取总RNA，得室温下干燥的RNA沉淀物，溶于DEPC水中。取其溶液置紫外分光光度计下读取260 nm 和280 nm 的吸光度值（A值），以A260/A280 比值（R值）计算核酸纯度。本实验提取的RNA R值均在1.8~2.0，并将样品浓度调至1 g/L 备用。
1.7逆转录制备cDNA 逆转录严格按TOYABO 公司逆转录试剂盒操作。
1.8 PCR 反应 IL-1β上游引物为5’-AAACA GATGA AGTGC TCCTT CCAGG-3’，下游引物为5’-TGGAG AACAC CACTT GTTGC TCCAA-5’，产物大小为391 bp。TNF-α 上游引物为5’-AGCCG ATGGG TTGTA-3’，下游引物为5’-ACTTG GGCAG ATTGA-3’，产物大小为266 bp。 β-actin 上游引物为5’-CAGAG CAAGA GAGGC ATCC-3’，下游引物为5’-CTGGG GTGTT GAAGG TCTC-3’，产物大小为217 bp。用 2μL上样缓冲液将10 μLPCR产物稀释混匀后，上样于2%琼脂糖凝胶的样品孔中，电泳1 h 后置凝胶自动成像系统观察、记录并分析结果。
1.9 神经组织蛋白提取 神经组织提取、预处理同“1.6”，将剪碎的部分神经组织置预冷的PIPA裂解液内冰上匀浆，离心提取蛋白，BCA法蛋白定量。
1.10 western blot 法蛋白检测 常温制备12%的SDS-PAGE分离胶，上样（根据蛋白定量结果），90 V恒压电泳30 min，转至PVDF膜，常温下5% 脱脂奶粉封闭1.5 h，PBS洗膜3次，加入Src (1:1000)、p-Src (1:500) 、Erk1/2 (1:1 000) 或p-Erk1/2 (1:500) 一抗，4 ℃ 孵育过夜，TBST洗膜3次，二抗 (1:1 000) 孵育2 h，加入ECL发光液，成像仪成像，Quantity One软件分析蛋白条带灰度值。
1.11 病理学观察 用药8周，坐骨神经功能指数检测完毕后，麻醉大鼠，打开胸腔，暴露心脏，剪开右心耳，先用预冷的PBS灌注冲洗，待无血性液体流出后，改用预冷4%多聚甲醛灌注。灌注完毕后，沿原手术切口切开皮肤及皮下组织，暴露坐骨神经，以吻合口为中心，向上、下各分离5 mm，取坐骨神经，放入4%多聚甲醛溶液中。向下端暴露腓肠肌，剪取后放入4% 多聚甲醛固定。常规石蜡包埋，切片后行HE染色。坐骨神经、腓肠肌染色后，光镜观察。
1.12大鼠腓肠肌肌纤维直径及横截面积测定 在400倍视野下，随机选取3个视野，每个视野下随机选取5个肌细胞，用Motic Images Plus 2.0 软件测量肌细胞直径及面积（每个肌细胞取最长直径和最短直径的均值）。
1.13 统计学处理 计量资料以均数±标准差（x± s）表示。样本均数比较采用单因素方差分析，组间比较采用 Duncan’s Multiple Range Test，以P<>为差异具有统计学意义。
2.1 坐骨神经功能指数 如Tab. 1所示，大鼠坐骨神经离断吻合后，模型组坐骨神经指数（绝对值）逐渐减小，但是恢复缓慢（2周、4周、8周）。与模型组比，甲钴胺给药组大鼠坐骨神经功能恢复较快，第2周起，坐骨神经功能指数（绝对值）降低显著（P<>P<>P<>
2.2 大鼠血清炎症因子的表达 如Tab. 2所示，给药后3 d，模型组大鼠血清中IL-1β和TNF-α显著升高，较之模型组，复元活血汤组大鼠血清中IL-1β和TNF-α显著降低（P<>P＞0.05），表明甲钴胺并不能减轻炎症反应。
2.3 大鼠神经组织炎症因子IL-1β和TNF-α mRNA 的表达 如Fig. 1、Tab. 3所示，术后给药2周，模型组大鼠坐骨神经组织IL-1β和TNF-α mRNA的表达仍显著升高（与假手术组比，P0.01），与模型组比，复元活血汤组和甲钴胺组大鼠坐骨神经组织IL-1β和TNF-α mRNA的表达显著降低（P0.01），表明复元活血汤可显著降低损伤神经组织炎症因子的表达。
2.4 大鼠坐骨神经神经组织p-Src、p-Erk1/2的表达 如Fig. 2、Tab. 4所示，假手术组大鼠坐骨神经组织p-Erk1/2表达量很少，模型组表达量显著增多(P<>P<0.01，较之模型组)。表明复元活血汤和甲钴胺可降低erk1>P<>P<>
2.5病理学观察 坐骨神经离断吻合术后，给药8周，光镜下观察神经纤维纵切面显示(如Fig. 3所示)，模型组神经纤维排列都比较松散，神经纤维排列较为紊乱、断裂；甲钴胺组与复元活血汤组神经纤维数量较多，排列较为整齐。各组大鼠坐骨神经镜下均未见神经瘤形成，未见明显瘢痕组织生成。
如Fig. 4、Tab. 5所示，光镜下观察腓肠肌横切面，均无炎性细胞浸润及细胞变性。模型组肌细胞直径和横截面积显著缩小（与假手术组比，P<>P<>
外周神经离断性损伤是临床常见的神经损伤，施行断端吻合术后，功能恢复缓慢，甚至难以恢复。本实验中，采用大鼠坐骨神经离断吻合术，制作外周神经离断性损伤吻合模型。
坐骨神经功能指数是通过观察动物行走步态，判断神经功能，是反映坐骨神经功能的重要指标。本实验中，模型组大鼠在术后2~8周，坐骨神经功能呈进行性改善，但进展缓慢，较之模型组，复元活血汤组和甲钴胺组大鼠改善显著。
坐骨神经离断性损伤后，远端轴突发生瓦勒变性，施万细胞增生，增生的施万细胞分泌神经营养因子，促进轴突向远端延伸[5]。然而，在断端吻合后，由于炎症反应，局部胶原纤维增生，会导致神经吻合口处瘢痕形成，阻碍再生轴突延伸，并导致神经内膜、束膜和外模与周围结缔组织粘连，压迫局部血管，影响神经再生与修复[6]。本实验中，模型组大鼠吻合口神经纤维间隙增大，排列紊乱，术后3 d，炎症反应明显，炎症因子分泌显著增多，至术后2周，神经吻合口局部仍有炎症因子明显表达。复元活血汤组大鼠吻合口神经纤维排列整齐、紧密，显著减轻炎症反应和减少炎症因子表达，表明复元活血汤可有效促进断端神经的再生与修复，可能与其减少吻合口局部炎症因子的表达，减轻炎症反应有关。
运动神经纤维通过神经-肌连接支配骨骼肌的活动，神经末梢也能释放神经营养因子营养肌组织。失神经支配的肌组织因废用和失神经营养等原因，常常会萎缩。本实验中，模型组大鼠术后8周，受坐骨神经支配的小腿三头肌肌纤维直径显著减小，萎缩明显，复元活血汤组和甲钴胺组大鼠因神经恢复良好，与模型组比，肌纤维萎缩显著改善。
Erk信号通路参与细胞迁移、存活、分化、增殖、代谢和转录等一系列细胞内活动[7]，其中的Erk1/2能把细胞外信号传递到细胞核，通过调节某些转录因子，如EIk2l、c2Myc、Fos、ATF2和Max等的活性，进一步调节相关靶基因的转录，促进某些细胞增殖，以及细胞因子及细胞外基质的分泌[8- 9]。Erk1/2也普遍存在于神经系统，广泛参与神经细胞的生理与病理过程。有研究证实，在脊髓挫伤和兴奋性毒性损伤时，损伤附近的邻近节段Erk1/2磷酸化增强[10-12]，进一步研究表明，通过抑制Erkl/2信号通路，可以抑制脊髓损伤后的炎症反应，减轻组织损伤，减少神经元的调亡，促进神经的功能恢复、轴突再生以及电生理学改善[13- 14]。也有研究显示，抑制 Erk1/2磷酸化，可减少小鼠脑击打伤后脑组织的缺损面积[15]。本课题组研究也表明，坐骨神经离断性损伤后，活化了Erk1/2信号通路，导致神经功能恢复缓慢，复元活血汤通过抑制Erk1/2磷酸化，促进了神经功能的恢复。
Src是细胞内非受体型酪氨酸蛋白激酶，磷酸化后，可激活包括Erk1/2在内的众多信号通路，在细胞存活、增殖、分化、迁移等方面发挥重要作用[16]。近年来，Src在神经系统的作用逐渐受到关注。赵景伟等[17]研究发现，脑室内注射PP2抑制Src磷酸化，可以降低脑缺血再灌注后NMDA受体磷酸化，并抑制NMDA受体向突触后膜致密体结构转移，抵抗延迟性神经元死亡。还有研究证实，通过抑制Src的活化，可以减少高眼压引起的神经节细胞凋亡和减轻面神经缺血性损伤[18-19]。亦有研究表明，通过抑制Src通路活化，可以减轻大鼠星型胶质细胞缺氧复氧性损伤[20]。本课题组研究表明，坐骨神经损伤后，活化了Src通路，复元活血汤通过抑制Src的磷酸化和其下游信号通路的活化，促进神经纤维的生长和功能的恢复。
综上所述，坐骨神经离断吻合后，断端吻合处发生炎症反应，活化局部神经组织IL-1β（TNF-ɑ）/Src/Erk1/2信号通路，诱导大量炎性物质的分泌，抑制施万细胞的增殖、髓鞘形成，导致近端轴突生长缓慢，延迟神经功能的恢复，致使神经支配的骨骼肌失神经营养性萎缩。
本实验中，本课题组发现，术后3 d-2周，复元活血汤显著减轻神经损伤后炎症反应和减少炎症因子的表达，抑制断端神经组织Src和Erk1/2的磷酸化。由此本课题组认为，减轻炎症反应，抑制Src/Erk1/2信号通路的活化，是复元活血汤促进坐骨神经损伤后的修复的机制之一。同时本课题组也观察到，甲钴胺可能通过其他途径（抑制炎症反应作用不明显），抑制损伤神经组织Src和Erk1/2的磷酸化，促进神经修复。然而，复元活血汤是否可促进施万细胞增殖、髓鞘形成和神经营养因子的分泌，以及是否通过调节其他信号通路作用来促进损伤神经的修复，尚需进一步探讨。
参考文献：略
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