高中原，孙更，李敏，谌茜，李萍，王雪融
南京医科大学基础医学院药理学系，南京 211166，江苏
摘要 目的：研究柚皮苷对非小细胞肺癌细胞生长的作用及机制。方法：应用SRB法检测柚皮苷对非小细胞肺癌细胞株生长的抑制作用。用Western blot法检测柚皮苷对p70S6K的调控作用。利用质粒过表达p70S6K，用SRB法检测过表达p70S6K后对柚皮苷抑制细胞生长作用的影响。利用小干扰RNA阻抑p70S6K的表达，用SRB法检测阻抑p70S6K的表达对柚皮苷抑制细胞生长作用的影响。结果：柚皮苷呈浓度依赖性抑制非小细胞肺癌细胞的生长，并且可以下调p70S6K的表达。过表达p70S6K可以削弱柚皮苷抑制细胞生长的作用，敲降p70S6K可以增强柚皮苷抑制细胞生长的作用。结论：柚皮苷通过下调p70S6K抑制非小细胞肺癌细胞的生长。
关键词 p70S6K；柚皮苷；非小细胞肺癌细胞
肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，其5年存活率明显低于其他恶性肿瘤[1]。大约85%的肺癌患者都属于非小细胞肺癌（non-small cell lung carcinoma，NSCLC），其中非小细胞肺癌又包括鳞癌、腺癌和大细胞癌等类型[2]。目前我们对于非小细胞肺癌的治疗主要采取手术、放疗和化疗相结合的手段[3]，但由于化疗副作用大，产生耐药性等问题，其对非小细胞肺癌的治疗仍然存在很多不足，因此继续寻找毒副作用较小，对非小细胞肺癌作用效果较好的天然药物仍然是抗肿瘤药物研究的一个重要方向。
柚皮苷属于黄酮类化合物，来源丰富，主要存在于番茄、橙、橘、葡萄柚等芸香科植物的果皮和果肉中。有研究表明，黄酮类化合物能抑制NF-KB的表达，从而发挥抗炎、抗氧化、抗肿瘤等药理作用[3，4]。近年来大量研究证实柚皮苷可以抑制多种肿瘤细胞的增殖[5-7]。但是其作用机制还不明确。
p70核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)是一个苏氨酸／丝氨酸激酶，它属于AGC激酶家族[8]。p70S6K可以通过促进mRNA的翻译，增加蛋白质的合成，从而促进细胞的生长[9]。研究表明，在许多肿瘤中常伴有p70S6K的表达增加或激活[8,10-11]。
本文主要研究柚皮苷对非小细胞肺癌细胞生长的作用，对p70S6K表达的调控作用，以及干扰p70S6K表达对柚皮苷作用的影响，以期阐明柚皮苷对非小细胞肺癌细胞的作用和机制。
1.1 细胞 人NSCLC细胞株A549/H460来源于美国菌种保藏中心（ATCC）。
1.2 试剂 RPMI1640培养液和胎牛血清购于Gibco公司。柚皮苷（10236-47-2）购自美国Sigma公司，用DMSO配成200mmol/L的储备液，贮存于-20℃。GAPDH (AP0063)和c-Myc (K422)兔多克隆抗体购于巴傲得生物科技公司。p70S6K(9202)和cyclin D1(2922)兔多克隆抗体购于美国Cell Signaling Technology 公司。
1.3 细胞培养 人肺癌A549/H460细胞株培养于含5%胎牛血清RPMI1640培养液中。
1.4 转染实验 细胞以5×105 密度接种于六孔板，按Lipofectamine 2000 说明书将100mmol/L p70S6K siRNA及control siRNA进行转染，转染48h后提取细胞总蛋白，进行Western blot检测。转染后24h重新接种于96孔板，进行SRB实验。p70S6K siRNA 有四个序列，购于上海吉玛基因有限公司，p70S6K siRNA靶向的序列分别为5′-CCA AGG UCA UGU GAA ACU A-3′; 5′-CAU GGA ACA UUG UGA GAA A-3′; 5′-GAC GGG GUC CUC AAA UGU A-3′; 5′-GCA GGA GUG UUU GAC AUA G-3′ . p70S6K的过表达质粒（pRK7-p70S6K）及其空载体(pRK7)由哈佛医学院 John Blenis教授馈赠。
1.5 细胞存活率的测定 以SRB染色法测定细胞存活率，具体方法参见文献[13]。
1.6 Western blot法检测柚皮苷对p70S6K蛋白表达的影响 A549和H460细胞接种于培养皿， 18h 后给予不同浓度的柚皮苷处理24 h，弃去培养基，用全细胞蛋白裂解液裂解细胞，提取总蛋白，进行Western blot 分析，具体方法参见文献[14]。
1.7 统计学方法 所有数据均采用均数±标准差（x± s）表示，采用SPSS18.0 软件进行数据分析，各组间数据差异采用t 检验分析， 采用GraphPad Prism 5 软件作图。P<>
2.1柚皮苷对A549和H460细胞株存活的影响 SRB法检测不同浓度柚皮苷对A549和H460细胞株存活的影响，结果显示，当细胞给予不同浓度柚皮苷处理72h，随着药物浓度的增加，柚皮苷对A549和H460细胞增殖的抑制作用逐渐增强，呈现浓度依赖性( Fig.1)。
2.2柚皮苷对p70S6K表达的影响 A549和H460细胞分别给予柚皮苷200μmol/L的浓度作用24h，Western blot结果显示，当给予柚皮苷刺激后，A549和H460细胞的p70S6K蛋白表达降低，并且与细胞增殖相关的蛋白cyclin D1和c-Myc的表达也降低( Fig. 2A-2B)。
2.3 过表达p70S6K可以部分拮抗柚皮苷对细胞生长的抑制作用 A549和H460 细胞分别转染p70S6K质粒及其对照空载体，与转染空载体相比，转染p70S6K质粒的细胞p70S6K蛋白表达明显上调( Fig. 3A和 3C)。转染质粒后给予不同浓度柚皮苷处理72h，以SRB法检测细胞的存活情况。结果显示，在同样给予柚皮苷的情况下，转染p70S6K质粒组柚皮苷的抑制率降低(Fig. 3B和3D)，说明过表达p70S6K可以部分拮抗柚皮苷抑制细胞生长的作用。与对照组相比，差异具有统计学意义（P<>
2.4 阻抑p70S6K的表达可以增强柚皮苷对细胞生长的抑制作用 A549和H460细胞转染对照siRNA和p70S6K siRNA，与转染对照siRNA组相比，转染p70S6K siRNA组的细胞p70S6K蛋白表达明显下调（Fig. 4A和4C），转染siRNA后分别给予不同浓度的柚皮苷处理72h，以SRB法检测细胞的存活情况，结果显示，在同样给予柚皮苷的情况下，转染p70S6KsiRNA组柚皮苷的抑制率升高（Fig. 4B和4D），说明阻抑p70S6K的表达可以增强柚皮苷抑制细胞生长的作用。与对照组相比，差异具有统计学意义（P<>
肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，居癌症相关死亡的首位[1]。尽管肺癌的早期诊断和规范化治疗都取得了一定的进步，但多数患者确诊时已处于中晚期，因此化疗和放疗相结合仍是治疗肺癌的主要手段，但化疗的副作用较大，并且相当一部分患者对化疗药物产生耐药性，因此，寻找到高效、低毒的天然药物是当前的一个研究方向。人们食用的许多天然物质中所含成分都具有抗癌的功效，如姜黄素、蒜臭素、越桔等[15-17]，这些天然物质由于其毒副作用小，所以在肿瘤的治疗中具有广阔的应用前景，对这些天然药物的抗肿瘤研究便显得尤为重要。
柚皮苷是一种天然黄酮类化合物，来源于芸香科柑橘属植物柚的未成熟或近成熟的干燥外层果皮中提取出的淡黄色的黄酮类化合物[18]。大量研究表明，黄酮类化合物在抗氧化、抗炎、抗细胞凋亡等方面具有较强的生物活性[19]。近年来，黄酮类化合物抗肿瘤作用已经得到广泛研究[20]。其中柚皮苷对肝癌、宫颈癌、W256癌肉瘤、结肠癌等的抗肿瘤效果已经得到证实[18, 21-24]，有研究发现，柚皮苷通过上调Bax/Bcl-2,激活caspase-3诱导HepG2细胞的凋亡[21]。但柚皮苷对于非小细胞肺癌的作用机制还未阐明。
核糖体40S小亚基S6蛋白激酶( p70S6K) 是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mammalian target of rapamycin complex1，mTORC1) 的重要下游信号分子之一。它主要参与调控细胞的生长、存活、代谢、迁移和侵袭[25]。研究表明，p70S6K在细胞受到生长因子、氨基酸等刺激后，能够发生磷酸化而活化，通过磷酸化并活化下游的信号分子核糖体蛋白S6（ribosomal protein S6，rpS6或S6），从而促进mRNA的翻译和蛋白质的合成过程[26]。我们的研究发现柚皮苷可以抑制p70S6K的表达。为了探讨p70S6K在非小细胞肺癌细胞生长中的作用，我们用pRK7-p70S6K质粒过表达p70S6K和p70S6K siRNA敲降p70S6K，结果发现，过表达p70S6K能够削弱柚皮苷对非小细胞肺癌细胞生长的抑制作用，敲降p70S6K后可以增强柚皮苷对非小细胞肺癌细胞生长的抑制作用。这表明，p70S6K可能是柚皮苷抑制非小细胞肺癌细胞生长的作用靶点。
此外，我们的研究中柚皮苷呈浓度依赖性抑制非小细胞肺癌细胞的生长，尽管抑制率不是很高，但作为一种天然药物，这可以通过与临床上化疗药物的联合应用，产生更好地抗肿瘤效果。
参考文献：略
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