李少华1，伊力哈木江·克尤木2，徐琦3，邵培培1，程路峰1
1新疆医科大学基础医学院药理学教研室，2第一附属医院心外科，
3基础医学院免疫学教研室，乌鲁木齐830011，新疆
摘要 目的：探讨依普利酮（EPL）对慢性心力衰 (CHF)患者CD4+T淋巴细Kv1.3等通道的 mRNA及蛋白质表达的影响。方法：收集慢性心衰Il、Ill期的患者及正常人全血样本（30例20例）。免疫磁珠分选外周血CD4+T淋巴细胞，利用流式细胞仪检测其纯度，CCK-8法检测不同浓度的EPL对CD4+T淋巴细胞增殖的影响。共分为3组，Control组、CHF组及CHF+EPL组。RTqPCR检测各组培养体系中的Kv1.3、KCa3.1和 CRAC通道mRNA的表达；In-cell Western blot技术检测CD4+T淋巴细胞膜上Kv1.3通道蛋白质的表达。结果：EPL的最佳抑制浓度为30μml/L；CHF组Kv1.3通道的mRNA和蛋白质的表达分别是Control组的10·74倍和1.20倍（P<>< 0·01）；chf组kca3.1和crac="">< 0.01)="" ,chf+epl组kca3.1和crac="" 通道mrna="" 的表达比chf组分别降低了19.30％和37.14％（p="">< 0·01="">结论：CD4+T淋巴细胞的三种离子通道的mRNA和/或蛋白质在慢性心力衰竭情况下均有高表达，依普利酮均能明显下调三种离子通道的mRNA和/或蛋白质，其中Kv1.3通道的变化尤为突出，推测醛固酮受体拮抗剂可能通过抑制CD4+T淋巴细胞膜上的Kv1.3通道的激活，减少T淋巴细胞的活化/增殖，最终抑制CHF过程中炎症作用的发生发展而对心衰有利。
关键词 慢性心衰；CD4+T淋巴细胞；依普利酮Kv1.3通道；抑制
慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF)是心肌细胞外基质（成纤维细胞，胶原，基质金属蛋白酶等）长期累积导致的心室僵硬和舒张充盈受损醛固酮(ALD)已被证实可以通过多种信号通路致心、肾等器官的纤维化[2]。临床试验已证实ALD受体拮抗剂可进一步降低心衰患者死亡率。现有的急慢性心衰诊治指南中,ALD受体拮抗剂被推荐联合用于心衰的治疗[3]。依普利酮(epierenone,EPL)是第二代ALD受体拮抗剂，具有毒副作用小，特异性强的特点[4]。免疫应答参与心力衰竭的进程，心衰后期成纤维细胞增殖正是炎症修复的重要表现。多种免疫细胞和/或炎症因子已被证明直接或间接参与心肌纤维化进程[5]，这些细胞因子可以刺激T淋巴细胞的活化/增殖。在人T淋巴细胞中，Kv1.3钾通道可通过调节细胞膜静息膜电位，为持续的ca2+内流提供驱动力，在T细胞的激活、增殖和炎症分子分泌中发挥关键作用[6-7]。Kv1.3钾通道主要分布于T淋巴细胞，特异性阻断Kv1.3通道则不影响其他细胞功能和正常的T细胞免疫性，因此Kv1.3通道被认为是各种免疫性疾病治疗的新靶标[8]。有研究显示9,Kv1.3通道于自发性高血压大鼠及高血压患者外周血淋巴细胞中高表达 (mRNA和蛋白质水平均显示），其电流密度约为正常组的2倍。慢性心力衰竭后期（失代偿）时，Kv1.3通道是否被活化致T细胞活化／增殖未见报道，本研究拟探究EPL对CHF患者外周血CD4+T淋巴细胞Kv1.3通道的影响在延缓疾病发生发展的过程中发挥的关键作用。
1材料与方法
1.1.1 实验对象及病例筛选条件 CHF组：30例，均为新疆医科大学第一附属医院2016年10 月至2017年5月心脏外科接收的住院患者，其中男18例，女12例，年龄32~69岁。人选标准：（1）确诊为CHF至少3个月；(2)NYHA心功能分级为2级；排除标准：（1）急、慢性感染，炎症性疾病；（2）自身免疫性疾病；（3）近期不稳定型心绞痛及急性心肌梗死（3个月内）；（4）风湿性疾病近期（3个月内）有风湿活动；（5）糖尿病、甲状腺功能亢进或其它内分泌疾病；（6）近期使用影响免疫反应药物（如皮质类固醇）；（7）严重肝、肾功能不全；（8）肿瘤；（9）妊娠。对照组：20 例，均选自门诊健康体检者，男10例，女10例，年龄25~69岁。两组年龄及性别构成相比差异均无统计学意义。
1.1.2 主要仪器及试剂 CT15RE型低温高速离心机（Hitachi，日本），Midi型磁力分选器 (MACS,德国） ，25巧型分选柱（MACS，德国）， H 40型C02细胞孵育箱（Olypus,日本），免疫磁珠分选器（德国美天旎），0.5-10、20-200和 100-1000UI型移液枪（Ephendorf,德国）,CD4+T cell solation kit，Human，FACS Calibur流式细胞仪（美国BD公司），人淋巴细胞分离液（LTS1077，Sigma)，胎牛血清、BPM11640培养基（Hyclone sybr试剂盒（Life technologies)，KCNN1.3小鼠抗人（abcam，ab105595），ß-actinab8226（Abcam）， IRDyc ® 800CW Goat anti-mouse( LI-COR)等。
1.2.1 免疫磁珠分离CD4+T淋巴细胞 CHF 组及正常组静脉取血10 mL,用PBS和外周血1：1 稀释后得到稀释液缓慢的平铺于分离液上，2 000 r/min离心20 min(快升缓降）仔细吸取单个核细胞层，用PBS清洗3次，台盼蓝染色计数，调整细胞浓度为1010个/ L。阳性分选获得CD4+T淋巴细胞，用90 μL Buffer(2 mmol/L EDTA,0.5％ BSA，溶解至500 mL的PBS, pH调节为7.2）加 10 μL CD4+T cell Biotin-Antibody Cooktial混悬均匀于4 ℃孵育5 min,用2 mLbuffer重悬，重复清洗3次，弃上清；用100μL buffer重悬细胞加20 μL Anti-Biotin MicroBeads混匀于4 ℃孵育10 min；用buffer重悬，重复清洗3次；用0.5mL buffer重悬细胞，将LS分离柱置于磁场中，用3 mL buffer润洗柱子加0.5mL细胞悬液，用3 mL buffer冲洗柱子，将磁柱移出磁场，于磁场外将buffer 推出，收集流出液。
1.2.2 CD4+T淋巴细胞的分组与培养 用完全培养基[ 10％胎牛血清10 μL/mL,mIL-2(2.5× 106 IU/mL)，TGF-β1（2 μg/mL)及1％双抗]混悬上述细胞，并均匀的种在3个直径10 cm的培养皿（用含10 μg/mL Anti-CD3，10 μg/mL 包皿）中，将Control组、CHF组和(CHF +EPL)组的CD4+T淋巴细胞，于37 ℃、5％CO2的孵育箱中孵育12 h，对（CHF + EPL）组分别给予30 μmol/L EPL和生理盐水。将3组细胞置于37 ℃、5％CO2的孵育箱中孵育48 h，待测。
1.2.3 流式细胞仪检测CD4+T细胞的纯度 收集各组孵育的CD4+T淋巴细胞，加1 mL RPMI1640（10％胎牛血清，50 ng/mL细胞刺激剂 PMA、1 μg/mL离子霉素、0.7 μL/mL高尔基阻断剂) ,做细胞计数；按1 500 r/imin离心10 min(缓升缓降) ,将细胞浓度调整到1 × 106个/mL；取出上述调整浓度后的细胞悬液1 mL,置于巧mL离心管中，1 500 r/min离心10 min，弃上清，加入BPMI1640，混匀；置于5％CO2、37 ℃的培养箱中，孵育4 h做饥饿处理；1 500 r/min离心10 min, 弃上清，分别加CD3-PC7、CD8-PC5各10 μL，按照细胞表面抗原染色方法标记表面抗原，用CD3PC7、CD8-PC5标记CD4；于室温避光20 min,PBS 洗涤细胞一遍；加250 μL细胞固定/破膜剂(fixa-tion/permeabilization solution），避光，4 ℃孵育20 min；用1 mL 1 ×洗液(Perm/wash buffer)清洗， 1 500 r/min离心10 min，弃上清；重复清洗2遍，采用beckman coulter流式细胞仪进行检测，将 FSC（对应细胞的相对大小）和SSC（对应细胞内部复杂程度）进行调整以选择淋巴细胞，在FSC-SSC散点图上选定淋巴细胞群，由不同的细胞标记和门控检测不同的细胞亚群，通过cell Quest 软件对所有染色的细胞进行数据分析，并记录阳性细胞的百分比。
1.2 .4 RT-qPCR检测CD4+T淋巴细胞膜上的 Kv1.3、KCa3.1、CARC通路的mRNA 收集各组的CD4 +T淋巴细胞，107个/mL细胞加1 mL Trizol混匀于室温静置5 min，加1/5 Trizol体积的氯仿，充分振荡巧15 s于室温静置5 min，于4 ℃、15 000r/min 离心10 min（快升快降），收集上层清液于无RNA酶的EP管中按1：1加异丙醇于室温静置25 min,4 ℃、12 000 r/min离心10 min,弃上清。用无水乙醇现配75％乙醇溶液清洗，4 ℃、10 000 r/min离心5 min,重复3次，晾至RNA表面无液体。检测提取RNA的浓度和纯度。立即进行逆转录以防RNA裂解。用无RNA酶水稀释目的RNA至11 μL，加1 μL rander Primer于PCR 扩增仪中设定65 ℃，5 min后加体系（Thermo）（5 × Reaction Buffer 4 μL，RNAse inhibitor（RI）1 μL,DNTP mix2 μl），接着于PCR扩增仪上进行 Cycle2（1）65 ℃，5 min；25 ℃，5 min；42 ℃，60 min；70 ℃，5 min；Cycle3（1）4 ℃，。PCR扩增，于冰上配扩增体系（H2O，6 .4 μL,SYBR,10 μL， Primer,0.8 μL）加样品1. 8 μL。设定扩增程序 Cyclel（1）50.0 ℃，2 min；Cycle2（1）95.0 ℃，2 min；Cycle3（40）95.0 ℃，15 s，60 ℃，15 s;Cycle4 （1）60 ℃，15s；Cycle5（1）95 ℃，15s。见Tab.1。
1.2.5 In-cell Western blot检测CD4+T淋巴细胞蛋白的表达 收集各组CD4+T淋巴细胞用上述1640培养基混悬，分别布于耵型黑壁96孔板中，每孔加100 μL悬液即104个细胞，37 ℃孵育15min；每孔加50μL固定剂(40％多聚甲醛）室温下置于摇床上30r/min，20 min；轻轻吸去上清，每孔加100μL些封闭液（5％脱脂奶粉配置）室温下置于摇床上30r/min， 1 h；轻轻吸去上清，每孔加50μL-抗〈KCNNI. 3小鼠抗人，ab105595）于摇床上4 ℃，30r/min，过夜，用TBST洗脱一抗5 次，用2.5％脱脂奶粉溶液稀释二抗（1：1 000) ,每孔加50 μL二抗，于摇床上30 r/min避光孵育1 h，用TBST洗脱5次，弃洗脱液，用Odyssey的700 和800通道扫描孔板，中等扫描质量，169 μm的分辨率，3.0 mm焦距，亮度为5。
1.2.6 数据统计分析 运用SPSS 22.0软件对数据进行分析，组间比较采用单因素方差分析，P <>
2结果
2.1 流式检测CD4+T淋巴细胞的纯度 CD4+T淋巴细胞的纯度为98 .7％，超过80％，故具有研究代表性。用流式检测免疫磁珠分选法分选的 CD4+T淋巴细胞的纯度，流式检测结果见Fig·1。
Fig. 1 Purity Of CD4+T lymphocyte by now cytometry
CD4+T lymphocytes marked by APC，CD3 marked by FITC，Q2 was the double positive marker cells·
CD4+T淋巴细胞给药孵育48 h后给予CCK-8试剂孵育（37 ℃，5％CO2）4 h于紫外分光光度计上检测，得到下图的曲线，见 Tab. 2,Fig. 2。0.1，0.3，1，3，10，30，100 μmol/L 的EPL对CD4+T淋巴细胞CCK-8染色的OD值抑制率曲线，抑制率公式：抑制率（％）=（OD1- ODn+1)
/ OD1 × 100％，n=1，2，3 ...（CD4+T增殖的抑制率经Hill方程：拟合后R=0.995得到IC50：2.4 μmol/L)，30 μmol/L的EPL大约抑制CD4+T淋巴细胞增殖达83.4％，故后续实验以30 μmol/L EPL为实验深度进行干预。
CHF组的Kv1.3、KCa3.1、CRAC通道的mRNA表达是Control组的10.74、4.73、3.77倍（P<0.01 )， chf="" +="" epl组较chf组的三组离子通道的mrna="" 表达的抑制率为64.80％、19.03％和37.14％(p="">< 0.01）。将control组结果标化，chf组与control="">患者的CD4+T淋巴细胞膜上Kv1.3、KCa3.1、CRAC通道mRNA表达，以及给予了EPL培养后各相关基因表达的变化，见Tab.3及Fig. 3。
3讨论
目前对慢性心衰发生机制的研究主要涉及神经内分泌系统和免疫系统肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）的激活[1]。RAAS过度激活是导致心肌纤维化的主要原因，故血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)类及β-受体阻滞剂被经典用于预防和逆转心肌纤维化，大量研究表明醛固酮（ALD)通过其信号转导通路在冠心病、急性心梗、心肌缺血及心衰的发生发展中起关键作用。 ACEI类及β-受体阻滞剂可减少ALD在心衰时的释放，但是ACEI的长期应用会引起“ ALD逃逸' 现象[3]。近年来，循证医学显示醛固酮（ALD）受体拮抗剂可以进一步地降低心衰患者死亡率[2] ，此心衰现代治疗方案中联合使用ALD受体拮抗剂具有重要的意义。依普利酮是第二代ALD 受体拮抗剂[4]，相较于第一代ALD受体拮抗剂螺内酯，其具有选择性高，毒副作用小的优势。
近年来，心衰的炎症学说被广泛的认可，他们认为在炎症反应过程中，免疫细胞通过产生炎症介质，促进了心力衰竭的进展和恶化[5]。其中T 淋巴细胞在慢性心衰中的作用得到共识，目前被接受的T细胞活化的信号通路网络调控模式为：T 淋巴细胞活化后，促使钙释放激活Ca2+（Ca2+ lease activating Ca2+，CRAC）通道打开，上调内质网的钙库释放Ca2+的量，Ca2+内流增加可通过钙依赖性的蛋白激酶通路启动各种细胞因子的转录，使其发挥免疫效能[10] KCa3. 1通道作为钙离子激活的钾离子通道会使膜电位超极化，使得 Ca2+持续内流，Kv1.3通道则维持T淋巴细胞的静息电位，使T细胞处于能被活化的状态[11]。选择性阻断/基因敲除Kv1.3通道将抑制效应性T 淋巴细胞的活化及效应功能[12] 。Kv1.3钾通道敲除小鼠表现出实验性自身免疫性脑髓炎的发生率及程度的明显降低，药理性阻断或基因性抑制 Kv1.3通道致CD4+T淋巴细胞向Treg细胞的分化对多发性硬化（MS）可能是有益的[13] 。由于 Kv1.3钾通道主要分布于T淋巴细胞，以TEM细胞居多，特异性阻断Kv1.3通道则不影响其他细胞功能和正常T细胞免疫性，因此Kv1.3通道被认为是各种免疫性疾病治疗的新靶标[14]。
近年来有研究显示[9]，高血压患者T淋巴细胞的活性增强，Kv1.3通道于自发性高血压大鼠及高血压患者外周血淋巴细胞中高表达（mRNA 和蛋白水平均显示），其电流密度约为正常组的2 ~3倍，给予ARB类药物替米沙坦48 h，该电流可以被抑制至正常组水平。前期研究表明，慢性心衰患者的外周血中IL-17A、IL-6、IL-2、IL-4、IL-10、TGF-β和IFN-γ细胞因子的含量均显著升高（此部分数据还未发表），也说明免疫激活是慢性心衰的主要表现。
本研究获得的人外周血中的CD4+T淋巴细胞的纯度可达到98.7％，说明目标细胞大部分为 CD4+T淋巴细胞，实验结果较为可信。30 μmol/L的EPL对CD4+T淋巴细胞增殖的抑制率可达 83.41％，对于细胞实验来说，该浓度比较有临床意义。慢性心衰患者CD4+T淋巴细胞的Kv1.3、 KCa3. 1及CRAC通道的mRNA的表达均较正常组显著增加，给予30 μmol/L EPL后，其表达均被显著抑制，其中Kv1.3通道抑制最为明显，抑制率约为64.80％（P<>Kv1.3蛋白抑制了37.25％（P <>
综上所述，Ⅱ、Ⅲ期的慢性心衰患者外周血 CD4+T淋巴细胞活化/增殖受Kv1.3等通道的调控，醛固酮受体拮抗剂依普利酮对慢性心衰患者外周血CD4+T淋巴细胞膜上的Kv1.3通道具有明显抑制作用，可能是通过对CD4+T淋巴细胞膜上的醛固酮受体抑制后间接抑制Kv1.3通道的表达及功能，从而抑制了T细胞的活化/增殖，表现出较好的免疫抑制作用。但仍需进一步深人研究，这为临床慢性心力衰竭的治疗提供了新的研究思路和治疗方向，T淋巴细胞的Kv1.3通道在疾病及治疗的靶向地位作用将更加受到重视，为寻找新的靶向药物奠定了基础。
参考文献略
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