晚期糖基化终末产物（AGE）是蛋白质、脂类、核酸等大分子物质的游离氨基与还原糖通过非酶糖化反应生成不可逆及不易降解的大分子棕色产物。AGE在光老化皮肤中大量堆积，并在光老化多个环节中起重要作用。既往认为AGE极难降解，而现在发现，AGE可被巨噬细胞、成纤维细胞等胞吞后被溶酶体组织蛋白酶B（CatB）、CatL、CatD或泛素蛋白酶体降解清除。许新雅等观察蛋白酶活性抑制剂、慢病毒转染介导的蛋白酶高表达对皮肤成纤维细胞降解吞入胞内AGE的影响。
组织蛋白酶D调控皮肤成纤维细胞降解晚期糖基化终末产物的研究
许新雅 许庆芳 郑跃 黎钰莹 黄云芬 龚子鉴 陆春 赖维
作者单位：中山大学附属第三医院皮肤科
【引用本文】许新雅，许庆芳，郑跃，等. 组织蛋白酶D调控皮肤成纤维细胞降解晚期糖基化终末产物的研究[J]．中华皮肤科杂志，2018, 51（9）: 647-652. doi：10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2018.09.003
【关键词】 组织蛋白酶D； 成纤维细胞； 糖基化终产物，高级； 降解
分别以CatB + CatL、CatD以及20S蛋白酶体的酶活性抑制剂CA074Me、天冬氨酸酶抑制剂（pepstatin A）、MG⁃132处理皮肤成纤维细胞，CA074Me、pepstatin A、MG⁃132组分别加入AGE⁃BSA孵育8 h，而对照组加入磷酸盐缓冲液（PBS）。孵育8 h后，置换含相应抑制剂的新鲜培养基继续培养24 h，流式细胞仪检测各时间点胞内AGE⁃BSA平均荧光强度，研究抑制蛋白酶活性对皮肤成纤维细胞降解吞入胞内AGE影响。结果显示，抑制CatB、CatL及蛋白酶体活性对皮肤成纤维细胞降解吞入胞内AGE⁃BSA无显著影响，但抑制CatD活性可显著降低皮肤成纤维细胞对吞入胞内AGE-BSA的降解。
图1 流式细胞仪检测蛋白酶活性抑制剂对皮肤成纤维细胞降解吞入胞内AGE-BSA的影响 a：与AGE-BSA组相比，P <>
以不同浓度pepstatin A（37.5、75、150 μmol/L）或PBS处理皮肤成纤维细胞，加入AGE-BSA孵育，方法同前，ELISA检测各时间点胞内AGE-BSA平均浓度，研究不同浓度CatD抑制剂pepstatin A对皮肤成纤维细胞降解吞入胞内AGE-BSA的影响。结果显示，pepstatin A可抑制皮肤成纤维细胞降解吞入胞内AGE-BSA，呈浓度依赖性。
图2 荧光显微镜下观察慢病毒转染成纤维细胞的绿色荧光蛋白表达情况（× 100） 2A：空白对照组； 2B：空载病毒转染组； 2C：CatD高表达慢病毒转染组
因pepstatin A除了抑制CatD活性外，还抑制CatE活性。为排除CatE的调控作用，进一步通过构建CatD过表达慢病毒载体，研究特异性上调皮肤成纤维细胞CatD表达和活性对其降解吞入胞内AGE-BSA影响。结果显示，高表达CatD可显著促进皮肤成纤维细胞对吞入胞内AGE-BSA的降解。
综上，CatD可促进皮肤成纤维细胞降解吞入胞内的AGE-BSA。前期研究已发现光老化皮肤及皮肤成纤维细胞CatD表达均下降，并且光老化抑制了皮肤成纤维细胞对吞入胞内AGE的降解。本研究仅从皮肤成纤维细胞模型上研究证实了CatD对胞内AGE降解的调控作用，而在动物模型、人体光老化皮肤中CatD表达是否与AGE堆积相关尚未研究。
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