赵丽，华夏，谭晔 恩施土家族苗族自治州中心医院急诊科，恩施445000，湖北 赵丽，女，本科，主要研究：消化系统疾病。 摘要 目的：探讨内质网相关降解蛋白Derlin-1对人结肠癌SW480细胞凋亡的影响及其可能的作用机制。方法：采用sh-Derlin-l -pGPU6/Neo质粒转染构建瞬时敲除Derlin-1基因的SW480细胞株，应用实时定量PCR和免疫印迹验证Derlin-1基因和蛋白的低表达，采用CCK8法检测SW480细胞增殖情况，流式细胞仪检测SW480细胞凋亡情况，Western blot检测SW480细胞中凋亡蛋白Bcl-2、Bax表达量和ERK磷酸化水平。结果：使用pGPU6/Neo载体能够稳定地抑制SW480细胞中Derlin-1的表达，sh-Derlin-l组细胞增殖率相对于对照组显著降低、凋亡率显著升高(P<0. 05)，western=""><>结论：Derlin-1表达的降低能抑制ERK信号通路活化，进而诱导人结肠癌SW480细胞凋亡、抑制增殖。 关键词 内质网相关降解蛋白；人结肠癌细胞；增殖；凋亡；ERK信号通路 中图分类号：R965.2 文献标志码：A 文章编号：1009-2501( 2018)12-1353-06 doi:10. 12092/j. issn. 1009-2501. 2018. 12. 006 结肠癌属于全世界常见的消化道恶性肿瘤，其导致的死亡率位居癌症中第3位[1]。目前结肠癌的干预策略是早期诊断、早期干预，以期提升结肠癌患者术后化疗效果，进而改善患者生存质量及降低死亡风险[2]。随着分子生物学技术发展，深入探讨结肠癌细胞中相关基因的表达及其作用机制，有助于结肠癌的综合干预[3]。 内质网相关降解蛋白( Derlin-1)属于内质网膜上的跨膜蛋白，在内质网相关降解途径中起着关键的作用，Derlin-1介导错误折叠蛋白向细胞质中转运[4-6]。Derlin-1作为一种公认的致癌基因，在多种恶性肿瘤细胞中呈现高表达状态，在肿瘤发生发展中发挥着重要的作用[7]。早期研究发现Derlin-1能够诱导肝癌细胞中新生血管的形成[8]，还可以介导ERK信号通路活化促使基质金属蛋白酶MMP-2及MMP-9表达诱导非小细胞肺癌的侵袭[9]，并且其还与肺癌、乳腺癌的淋巴结转移相关[10]。近年来也发现Derlin-1在结肠癌组织中呈高表达状态，并且其表达量与患者的临床病理学特征高度相关，可作为结肠癌的检测指标[11]；研究报道Derlin-1在结肠癌细胞中表达量显著升高，并且还能促使结肠癌细胞增殖[12]。因此，本文采用RNAi技术干扰人结肠癌SW480细胞中Derlin-1基因表达，探讨Derlin-1低表达对SW480细胞增殖、凋亡的影响。 1.1 材料及试剂 sh-Derlin-l -pGPU6/Neo转染质粒由上海生工和捷瑞生物公司合成；Lipo-fectamine 2000转染试剂盒购自Invitrogen公司（批号：HBS062154）；TRIzol试剂(批号：1063-25-8)，SYBR定量PCR试剂盒（批号：PY360-574）由Omega公司提供；RNA逆转录试剂盒(批号：1120-36-50)由TaKaRa公司提供；DMEM培养基（批号：JS01257）、胎牛血清（批号：HR036247）及胰酶（批号：1026-36-624）购自美国Gibco公司；兔抗人β-actin（批号：ab5013627）、Derlin-1（批号：ab1025477）、Bcl-2（批号：ab3624710）、Bax（批号：ab3602519）、ERK(批号：ab2255147)及p-ERK（批号：ab6305295）购自英国Abcam公司，二抗购自上海谷歌生物公司。 1.2 细胞培养及转染 人结肠癌SW480细胞购自美国ATCC细胞库，采用DMEM培养基，含10%胎牛血清；每隔3d传代1次，细胞培养条件为37℃、5% CO2的恒温环境。实验分为对照组、空质粒组及sh-Derlin-l组（转染sh-Derlin-l -pG-PU6/Neo质粒）。转染前1d消化重悬细胞，以1×105个细胞密度接种于6孔板中，当细胞贴壁生长至70%~80%时，以脂质体Lipofectamine2000转染说明书进行操作，转染空质粒及sh-Der-lin-l-pGPU6/Neo质粒，培养48 h提取总RNA、72h提取总蛋白，筛选最佳质粒浓度。后续实验采用20 μmol/L的sh-Derlin-l质粒转染进行。 1.3RT-PCR实验 细胞转染2d后提取各孔细胞中总RNA水平，反转录操作获得cDNA。采用Real-time PCR方法分析Derlin-1 mRNA表达水平，反应体系为：95℃3 min，95℃5s，60℃15 s，72℃15 s，共39个循环，65℃15 s，采用2 -AACt法计算分析mRNA相对表达水平。Derlin-1引物序列为，F：5'-CCCAAGCTTATCTCGGA-CATCGGGG-3',R:5'-GCTCTAGATCACTGGTCTC-CAAGTCG-3'；βactin引物序列为，F：5'-GGCG-GCACCACCATGTACCCT-3',R:5'-AGGGGCCG-GACTCGTCATACT-3'。 1.4 Western blot实验 细胞转染2d后提取各孔细胞中总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度，加入适量缓冲液100℃煮沸变性7 min，每孔上样50 μg进行SDS-PAGE凝胶电泳，待完成后进行电转实验，将蛋白电转至NC膜，用5%脱脂牛奶封闭1.5 h后，采用兔抗人β-actin、Derlin-1、Bcl-2、Bax、ERK及p-ERK抗体溶液（1：1 000稀释比）反应过夜，TBST洗膜3次，每次10 min后，加入羊抗兔二抗(1：3 000)室温反应60 min，采用ECL化学发光法检测蛋白的表达量。 1.5 CCK8实验 转染SW480细胞24 h后消化重悬细胞，按每孔2 000个细胞接种于96孔板中，待细胞贴壁后记为1d，分别在1、2、3、4、5d吸净96孔板中的培养液，每孔加入10 μL CCK8试剂溶液，37℃、5% C02的恒湿培养箱中孵育2h后，置于酶标仪450 nm波长处测定吸光度OD值。 1.6流式细胞术实验 按照“1.2”项操作处理细胞后，收集细胞制备成悬液，按照凋亡测定试剂盒说明书操作，PBS清洗细胞1次，加入AnnexinV/FITC和PI染色15 min后，利用流式细胞仪检测细胞凋亡率。 1.7数据处理 采用SPSS 20.0软件进行统计学处理，数据采用均数±标准差（x+s），组间比较采用Bonferroni分析，同时采用单因素非参数检验。P <0.> 2.1 不同浓度sh-Derlin-l质粒的筛选 采用RT-PCR及Western blot技术验证了sh-Derlin-l质粒转染SW480细胞后对Derlin-1表达的影响。10、20、30、50 μmol/L浓度的sh-Derlin-l质粒转染细胞后可明显抑制Derlin-1蛋白及mRNA表达，与对照组相比差异均有统计学意义(P<0. 05)，并且20="" μmol/l浓度的sh-derlin-l质粒转染对derlin-1表达的抑制效率最高；空质粒组细胞与对照组相比derlin-1蛋白及mrna表达量没有统计学差异(p="">0.05)。见Fig．1。
2.2 Derlin-1敲除对结肠癌SW480细胞增殖的影响 从第2天开始，sh-Derlin-l质粒转染组细胞增殖受到明显抑制，2~5 d内Derlin-1转染细胞的吸光度OD值显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；空质粒组细胞与对照组相比derlin-1蛋白及mrna表达量没有明显差异(p>0. 05)。见Fig.2。提示Derlin-1低表达可以抑制SW480细胞增殖。
2.3 Derlin-1敲除对结肠癌SW480细胞凋亡的影响 采用流式细胞仪检测了三组细胞凋亡情况，结果发现sh-Derlin-l质粒转染组细胞凋亡率(20.82%±3.27%)显著高于对照组(3.64%±0.85%)和空载体组(4.35%±1.08%)，差异比较有统计学意义(P<0.05)；而对照组与空质粒组细胞凋亡率比较差异没有统计学意义(p>0. 05)。见Fig.3。
2.4 Derlin-1敲除对结肠癌SW480细胞中凋亡蛋白表达的影响 采用Western blot方法检测了Derlin-1敲除对SW480细胞中Bcl-2、Bax蛋白表达水平的影响，结果发现sh-Derlin-l质粒转染组细胞中Bcl-2蛋白表达量显著降低，Bax蛋白表达量显著升高，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)；而对照组与空质粒组细胞中bcl-2、bax蛋白表达量比较差异没有统计学意义(p>05)。见Fig.4。
2.5 Derlin-1敲除对结肠癌SW480细胞中ERK通路的影响 采用免疫印迹方法检测了Derlin-1敲除对SW480细胞中ERK通路的影响，结果发现sh-Derlin-l质粒转染组细胞中p-ERK蛋白表达量显著降低，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)；而erk表达水平没有明显变化；对照组与空质粒组细胞中p-erk蛋白表达量比较差异没有统计学意义(p>0.05)。见Fig．5。
内质网为真核细胞重要的细胞器之一，是蛋白质合成、折叠及分泌的场所，也是胞内Ca2+的储存场所。胞内环境稳态是内质网发挥正常功能的前提条件，多种病理刺激（如缺血再灌注、氧化、炎性反应等）能够导致内质网应激反应。未折叠或错误折叠蛋白会在内质网腔聚集，诱导该类蛋白活性，抑制蛋白质合成，并促使有关蛋白降解及增强自噬作用，进而诱导内质网对堆积蛋白的处理，从而使细胞恢复正常功能[13]。研究还报道ERK信号传导途径介导蛋白降解[14]，具体是未折叠或错误折叠蛋白会被内质网上的跨膜蛋白复合体识别，从而携带进入胞液中被蛋白酶降解。
Derlin-1属于内质网跨膜蛋白复合体的重要组成之一，在蛋白跨膜转运中发挥重要作用。Derlin-1基因突变或缺失均会降低错误折叠蛋白的转运，引起内质网腔蛋白聚集及其超微结构破坏，从而导致内质网微环境及其功能异常[15]。早期研究发现Derlin-1在人乳腺癌中的高表达能够降低内质网应激对肿瘤细胞的破坏[16]，内质网应激能够促使Derlin-1水平升高，进而逆转出错误折叠蛋白，避免了肿瘤细胞的凋亡。因此，我们假设在结肠癌细胞中Derlin-1的缺失能够降低肿瘤细胞对抗内质网应激的能力，进而促使结肠癌细胞凋亡的发生。因此，本研究采用RNAi技术干扰人结肠癌SW480细胞中Derlin-1基因表达，观察了Derlin-1基因缺失对SW480细胞增殖、凋亡的影响。
首先采用qRT-PCR和Western blot技术检测了sh-Derlin-l转染细胞中Derlin-1基因和蛋白表达，结果发现20 μmol/L的sh-Derlin-l质粒转染能够显著抑制Derlin-1 mRNA及蛋白的表达。然后我们利用CCK8及流式细胞术实验观察了SW480细胞增殖和凋亡情况，发现Derlin-1缺失的细胞增殖受到明显抑制，而且凋亡率也显著升高；进一步对凋亡相关蛋白表达量考察发现，Der-lin-l缺失能够诱导促凋亡蛋白Bax表达，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达。早期报道Derlin-1可以介导ERK信号通路活化促使MMP-2及MMP-9表达诱导非小细胞肺癌的侵袭[9]，并且Derlin-1高表达还能通过ERK/MMP信号通路促使肿瘤细胞的恶化[17-20]。本文研究也发现Derlin-1缺失能够诱导人结肠癌SW480细胞中ERK磷酸化水平降低，提示Derlin-1表达的降低能抑制ERK信号通路活化，进而诱导人结肠癌SW480细胞凋亡、抑制其增殖。
参考文献略
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