[研究报道]葡萄糖氧化酶在对虾上的应用

摘要

本试验旨在研究葡萄糖氧化酶（GOD）对南美白对虾生长性能和肠道微生物菌群的影响。选用初重为1.54±0.08g的南美白对虾（Penaeus vanname）幼虾192尾作为试验对象，在对虾全价配合饲料中添加GOD，设4个不同的添加水平：0g/t、100g/t、200g/t、500g/t。通过30d的饲喂试验研究结果表明，配合饲料中添加200g/t、500g/t GOD的处理组，对虾30天增重率有升高趋势，分别比对照组提高5.24%、4.47%（P＞0.05），饵料系数有降低趋势，分别比对照组降低0.07、0.04（P＞0.05），肠道群落物种丰度显著增加（P＜0.05），变形菌门和拟杆菌门占比明显下降（P＜0.05），疣微菌门和放线菌门占比明显上升（P＜0.05）。说明GOD对对虾肠道菌群起到了正向调节作用，进而影响了对虾的生长，为其在对虾养殖中的应用提供了参考。

引言

葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase，GOD）是一种需氧脱氢酶，催化β-D-葡萄糖脱氢氧化生成葡萄糖酸内脂和过氧化氢，葡萄糖内脂继而转化为葡萄糖酸。葡萄糖氧化酶主要由青霉和黑曲霉等微生物产生，不同来源的葡萄糖氧化酶分子量有所不同，一般为130~180kDa。大多数真菌和酵母菌来源的葡萄糖氧化酶在酸性至中性范围内活性最佳，但也存在少数真菌来源的葡萄糖氧化酶在偏碱性范围内活性较好，适宜温度为30~60℃。葡萄糖氧化酶在食品中常作为抗氧化剂、酸度调节剂、膨松剂等，例如对水果、海鲜食品及茶叶等食品有显著的保鲜效果，在动物上应用时主要在肠道发挥作用，可以通过生物夺氧、降低pH、产生过氧化氢等方式调节肠道菌群平衡。自1997年7月26日被农业部第105号文正式批准列入《允许使用的饲料添加剂品种目录》以来，关于葡萄糖氧化酶在动物日粮上的应用研究有了越来越多的参考数据，主要涉及动物是禽和猪，研究证实了在仔猪日粮中添加葡萄糖氧化酶能够改善仔猪断奶应激，促进断奶仔猪生长，并减少腹泻；发霉饲料中添加不同水平的葡萄糖氧化酶对肉鸡生产性能、肠道 pH 值、肠道微生物、肠道发育及肝脏丙二醛含量均有不同程度的改善，同时可以降低霉菌毒素的侵害。然而，葡萄糖氧化酶在水产动物中的应用鲜见报道，本文对其在南美白对虾上的应用效果进行了评价，旨在探索其对对虾肠道微生物菌群结构的影响，指导葡萄糖氧化酶在水产领域的应用。

材料与方法

01

试验材料

葡萄糖氧化酶来源于青岛根源生物技术集团有限公司；试验饲料为广东**1号对虾配合饲料；水族箱循环系统及配件购自青岛海星仪器。

02

试验动物及设计

试验选择192尾1.54±0.08g南美白对虾（山东省莱阳市羊郡某育苗厂提供），随机分为4组，每个试验组4个水族箱，每个水族箱放养12尾对虾。每日投喂3餐，饱食投喂，摄食时间90±10min，水质条件为水温27±1℃、pH8.2±0.2、氨氮＜0.1mg/L、亚硝酸盐≤0.05 mg/L、弧菌数量＜2000 CFU/mL。采用气泵连续充气，循环水泵流量为12000 L/h，每天换水3%。

GOD的添加方式为先将其按0g/t、1000g/t、2000g/t、5000g/t的添加量制作成10倍的浓缩饲料（其他成分为：鱼粉30%、鱼油1.5%、复合维生素0.5%、破壁酵母15%、高筋面粉28%、粘合剂1.5%、载体为发酵豆粕），物料混合均匀后，水分调整到27%~30%采用低温挤压制成粒径为1.0mm的颗粒，采用沸腾流化床（进风口温度70℃，出风口温度52℃，烘干时间40分钟）烘干至水分11~12%，投喂时添加10%。

表1 试验组设计

03

指标测定

养殖试验开启前和结束后，将南美白对虾禁食16h，捞出用滤纸轻轻吸干虾体表面水分后，逐一对每个水族箱中对虾称重，记录每缸尾数，分别计算增重率、成活率和饵料系数。在无菌条件下，取出对虾肠道，切取中肠，分装至 2mL无菌EP管中，每管组织量为 0.5~2g，装好后样本迅速放入液氮中速冻，之后放于-80℃保存。加入干冰运送至青岛百迈克生物技术有限公司进行肠道微生物多样性分析。采用Illumina高通量测序样本原始数据，采用Trimmomatic软件进行序列质控，使用Flash 软件进行序列拼接、优化及统计。

结果与分析

01

水质监测

养殖期间水体pH7.9~8.0，水温28~30℃，亚硝酸盐0.019~0.041mg/L，盐度逐渐由28‰降低至23‰，在养殖第6-7天弧菌出现一次高点，采用1ppm BL1代谢产物进行控制，大部分时间弧菌数量＜2000CFU/mL。

图1 养殖期间水体弧菌监测

02

生长性能

试验结果表明，在配合饲料中添加100~500 g/t GOD，对南美白对虾生长、饵料系数和成活率无显著性影响（P＞0.05），但200g/ t、500g/t组增重率有升高趋势，分别比对照组提高5.24%、4.47%，饵料系数有降低趋势，比对照组降低0.07、 0.04，成活率有升高趋势，比对照组提高1.25%、4.16%（表2）。

表2 饲料中添加GOD对南美白对虾生长性能的影响

03

肠道菌群分析

对试验对虾肠道微生物高通量测序结果进行分析，OUT聚类和ACE指数分析显示，饲料中添加不同用量的GOD后微生物群落物种丰度显著增加（P＜0.05）（表3）。

表3 试验对虾肠道菌群α多样性统计

菌群丰度分析显示试验南美白对虾肠道主要优势菌群为变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）和放线菌门（Actinobacteria）（图2）。添加200g/ t、500g/t GOD，对虾肠道中变形菌门和拟杆菌门占比相比对照组明显下降（P＜0.05），变形菌门分别降低10.34%、15.51%，拟杆菌门分别降低31.41%、31.13%，两种添加量之间无显著性差异（P＞0.05）。疣微菌门和放线菌门占比明显上升（P＜0.05），疣微菌门占比分别是对照组的4.41和4.80倍，放线菌门占比分别是对照组的3.95和4.50倍（图3）。

图2 试验对虾肠道菌群丰度（门水平）

图3 对虾肠道菌群中的弧菌属占比变化

变形菌门占比降低主要体现在弧菌属占比降低，且随着GOD添加量增加，呈现下降趋势（P＜0.05）（图2），本试验中对虾肠道弧菌属中优势种为哈维氏弧菌，其占比变化对弧菌属占比变化具有较大影响（图4）。

图4 对虾肠道菌群中哈维氏弧菌占比变化

讨论

通过本实验室前期体外研究，发现葡萄糖氧化酶对水产常见致病菌如副溶血弧菌、溶藻弧菌、灿烂弧菌、哈维氏弧菌、气单胞菌等均有抑制作用。本试验中对葡萄糖氧化酶在对虾肠道中的作用和适宜添加量进行了验证。通过30天的饲喂试验，结果表明葡萄糖氧化酶的添加对对虾肠道微生物菌群产生了显著的影响，疣微菌门和放线菌门在总体肠道菌群总的占比升高，γ-变形菌纲和哈氏弧菌随葡萄糖氧化酶添加量增加呈现下降趋势。变形菌门和拟杆菌门中存在较多条件致病菌，其菌群占比降低能够降低肠道疾病患病几率和减轻病情。疣微菌门中部分成员具有多糖水解酶活性，动物肠道感染后具有相当程度的疣微菌门丰度降低的情况，而饲料中添加葡萄糖氧化酶后疣微菌门呈现上升的趋势，说明葡萄糖氧化酶对南美白对虾的肠道微生物群落起到一定正向调控作用。感染对虾和健康对虾的肠道菌群分析发现在感染对虾的放线菌门丰度少于健康对虾，说明添加葡萄糖氧化酶能够建立一个比较稳定、健康的对虾肠道群落。

结论

在对虾配合料中添加200-500g/t葡萄糖氧化酶可调控肠道菌群，提高微生物群落的丰度，菌群结构得到显著优化，生长性能表现出向好趋势。

END