溶菌酶( lysozyme)
溶菌酶( lysozyme) 是由英国细菌学家Fleming 于1922 年首先在人的眼泪和唾液中发现的, 因其具有溶菌作用, 被命名为溶菌酶。并且早在1907 年Nicolle就发表了相关报导，研究的是对枯草芽孢杆菌产生的溶解因子( lytic factor)。溶菌酶是一种序列保守、无毒无副作用的碱性蛋白，它广泛存在于动物、植物和微生物中, 是一种天然有效的抗菌酶。
01
溶菌酶分类与理化
性质按结构、分子量和来源不同，可将溶菌酶分为动物源溶菌酶、植物源溶菌酶、微生物源溶菌酶、噬菌体溶菌酶四种。其中动物型溶菌酶又可分为C型（chicken eggwhitelysozyme）、G型（goose egg-white lysozyme）和I型（invertebrate type lysozyme），大部分溶菌酶属于C型。其中，c 型溶菌酶在脊椎动物与无脊椎动物中均有存在。鸡蛋清溶菌酶是C 型溶菌酶的典型代表。蛋清中含量最高，而人乳、眼泪、唾液中的溶菌酶活性远高于蛋清溶菌酶。此外，植物源溶菌酶对溶壁微球菌的溶菌活性不超过鸡蛋清溶菌酶的1/3，但对胶体状甲壳质的分解活性则是鸡蛋清溶菌酶的10倍。溶菌酶纯品为白色或微黄色结晶体或无定型粉末，无嗅，味甜，易溶于水，不溶于丙酮、乙醚。湿度较低时，溶菌酶在室温下可长期保存。在酸性环境中，溶菌酶的化学性质稳定，耐热性好，pH4-7的范围内，100℃处理1min仍保持原酶活性；在碱性环境中该酶的热稳定性较差。食盐对溶菌酶的活性起活化作用；碱和氧化剂则抑制其活性。
02
溶菌酶抑菌机理
溶菌酶的溶菌性质主要归因于其能够有效水解细菌细胞壁的肽聚糖（Peptidoglycan，PG）（胞壁质），其水解位点是N-乙酰胞壁酸(N-Acetylmuramicacid，NAM，MurNAc)和N-乙酰葡糖胺(N-Acetylglucosamine，NAG，GlcNAc)间的β-1,4 糖苷键。现已证明，溶菌酶的活性位点通过6 个子位点（A-F）与6 个连续糖单体结合，之后结合到D 子位点的催化基团谷氨酸（Glu）35 和E 位点的天冬氨酸（Asp）52 通过一个双取代反应水解β-1,4 糖苷键（图1）。肽聚糖几乎是所有细菌细胞壁的组分，它赋予细胞壁一定的机械强度，使细胞能够抵抗细胞质与外部环境之间组成差异造成的渗透压，并维持细菌的特定形状（球形，棒形，螺旋形等），一旦肽聚糖层受到破坏，细菌就会因处于高渗环境而快速裂解、死亡。另外，细胞壁肽聚糖的合成和精细结构是多样的，同时肽聚糖也是高度动态更新的高分子，这个过程需要相关酶和蛋白质的精确协调和控制。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁肽聚糖含量存在很大差异，革兰氏阳性菌的细胞壁由多达40 层的肽聚糖以及磷壁酸组成，而革兰氏阴性菌通常只有不含磷壁酸的单层肽聚糖，并夹在内膜和含脂多糖的外膜之间，这些差异解释了为什么革兰氏阳性菌通常对溶菌酶敏感，而不是革兰氏阴性菌。然而，这种屏障可被动物的先天免疫系统的组分破坏，例如乳铁蛋白，防御素和导管素，其都能使革兰氏阴性菌的外膜透化。溶菌酶基于酶活性的裂解机制已经被广泛接受，但越来越多的研究表明溶菌酶的胞壁酶活性不是体外或体内细菌杀灭所必需的，溶菌酶作为一种阳离子抗菌蛋白，可以在带负电荷的细菌细胞膜上穿孔而形成有规则的离子孔道，从而引起胞内大量的K和内容物外流，最终导致细菌死亡（图2）。因此，溶菌酶的酶活性和阳离子特性都与抗菌活性有关。
图1人溶菌酶的酶学和阳离子性(A)溶菌酶的活性位点可通过6个子位点容纳最多6个连续的糖，并标注A- F。溶菌酶水解D位点NAM和E位点NAG之间的β-1 4糖苷键。(B)人类溶菌酶的带状模型，突出了重要的活性位点残基，天冬氨酸(蓝色)和谷氨酸(橙色)。(C)人体溶菌酶的静电势图(等电点，9.28；蓝色是阳性；红色是阴性；白色是疏水性)。因为细菌的细胞膜是阴性的，所以溶菌酶可能对细菌表面有一种增强的电荷介导的吸引力，提出了一种不依赖于酶催化的杀菌机制。
图2 溶菌酶的两种抑菌机制(A)新合成的PG单体由一个双糖组成，NAG通过一个附着的肽茎与NAM连接，而NAM被锚定通过脂质载体(灰色)到达膜。单体通过糖基转移酶(绿色)的作用被添加到延长链中。(B)溶菌酶水解NAM单体和相邻的NAG单体之间的β-1 4糖苷键。溶菌酶对PG的水解导致细胞壁不稳定和细菌细胞死亡。(C)溶菌酶也可以通过其阳离子性质的机理，即溶菌酶(红色柱体)在带负电荷的细菌细胞膜上形成孔隙，起到杀菌效果。
03
溶菌酶应用
鉴于溶菌酶的广泛分布和有效抗菌活性，其作为安全的抑菌剂在食品防腐保鲜、抗生素替代产品、抗菌药物、医疗诊断等方面有着广泛的应用前景。3.1 在食品防腐等方面的应用溶菌酶主要用作水产类制品、肉类、乳制品、果蔬及饮料的防腐保鲜，其有效性已被广泛证明，同时被很多国家批准使用，我国也已经颁布了溶菌酶作为食品添加剂的食品安全国家标准（GB1886.257-2016）。3.2在饲料行业中的应用
目前，滥用抗生素带来的负效应日益凸显，细菌、真菌对抗生素的抗药性正逐渐增强，这些问题的出现推动了科研人员对新型抗生素替代品的开发研究。溶菌酶由于其安全、无残留、对致病菌的杀菌效果，在饲料应用中有以下几方面（1）饲料的防腐剂和杀菌剂，饲料中添加溶菌酶可防止霉变，延长饲料的贮存期，减少不必要损耗。（2）防治疾病，Linderman等( 1992) 报道, 仔猪断奶时, 胰腺的分泌突然下降, 动物消化功能出现短期障碍,养分吸收降低而导致腹泻。添加溶菌酶制剂后能有效地控制因消化不良而引起的腹泻。因为溶菌酶可以提高内源性蛋白酶的活性, 促使抗炎多肽的产生,因而具有抵抗和消除炎症的作用。（3）促进消化吸收，有利于动物健康。在不用任何抗生素情况下，于饲料中添加饲用溶菌酶制剂，可促进饲料中营养物质的消化吸收，提高增重和饲料报酬，减少死亡。有文献报道采用添加了溶菌酶饲用酶制剂饲喂同一鸡舍的鸡，与对照组相比，产蛋数增加7.04%，蛋重增加7.06%，产蛋率提高5.76%，饲料转化率提高6.69%。（4）在水产养殖业中的应用，活菌制剂中有益微生物进入水产动物机体后,形成优势菌群，产生溶菌酶、过氧化氢等物质，可杀灭潜在病原菌，并且产生各种消化酶，有利于养分分解，具有高度安全性，不会对水产动物产生任何危害，也不会在水中和鱼体内有残留。
结语
与抗生素相比，溶菌酶具有广谱抗菌、无药物残留和耐药性的优势，作为饲料添加剂药物的替代品及在控制耐药菌，生产安全、绿色肉蛋奶食品方面将具有重要应用价值，但目前溶菌酶在饲料行业中还未普及应用。可能主要由于生产成本较高，现在市场上大部分溶菌酶是由鸡蛋清中提取，工艺繁琐且价格昂贵。目前，国内已有企业已通过基因工程菌工业化生产出溶菌酶，降低了成本。随着行业发展和研究的深入，相信溶菌酶将来会在饲料行业中作出巨大贡献。
作者：方安然
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