微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI)是DNA复制过程中形成大量移码突变、引起的核苷酸重复单元数量改变的现象，多种肿瘤中均可见MSI,常见于结直肠癌、子宫内膜癌和胃癌。MSI检测对多种实体瘤患者有重要意义，包括林奇综合征筛查、指导5-FU类化疗药物的选择、预后分层和筛选免疫检查点抑制剂获益人群等。目前，MSI检测主要包括PCR+毛细管电泳法、PCR+高分辨率熔解曲线法和NGS法，其中以PCR+毛细管电泳法为金标准。本文基于3种常用的技术平台并结合临床工作经验，对MSI相关机制、检测方法和质量控制等进行阐述，以进一步指导与规范我国MSI的检测工作。
1MSI的概念
微卫星是存在于原核生物和真核生物的基因组中，通常由1~6个碱基对组成的DNA串联重复序列，其又被称作简单重复序列或短串联重复序列,常见类型包括单核苷酸重复、二核苷酸重复、三核苷酸重复或四核苷酸重复等。微卫星的多态性主要由核心区重复序列的拷贝数差异引起，在一类重复序列中1个特定序列重复的丰度可能有较大差异，如在单核苷酸重复的情况下，poly(A)或poly(T)的密度比poly(G)或poly(C)的密度大300倍。在二核苷酸重复序列中，AC和AT较多，CG最少。由于DNA错配修复(mismatch repair,MMR)基因的突变或表观遗传发生变化，DNA MMR系统的正常功能被破坏、微卫星碱基对数量发生改变称为MSI。微卫星作为重要的序列组成部分，在基因组调控中发挥多种作用。微卫星DNA多样性，是构成人类基因组多样性的分子机制之一。
2MSI的发展史
1984年，英国莱斯特大学发现人类肌红蛋白基因中存在多态GGAT重复序列。1989年，由Litt和Luty首次提出“微卫星”的概念（图1)。微卫星是短而重复的DNA序列，具有分布广泛、非随机的特点，约占人类基因组的3%,主要分布在基因的非编码区和染色体末端。在真核生物中，高保真的DNA复制对维持细胞基因组稳定性和正常生理功能至关重要，但基因复制过程中受环境因素等影响，易发生核苷酸的错误掺入或缺失，引起基因组中重复序列次数的增加或丢失。在DNA聚合酶和多种修复机制的基础上，一般情况下DNA复制的错误会被修复。然而，当作为高保真DNA复制最后一道防线的MMR系统出现启动子超甲基化或基因突变时，DNA复制错误无法纠正并连续积累，微卫星的序列长度或碱基组成发生变化称为MSI,使基因组表现高突变表型。
1993年，研究者发现在遗传性非息肉病结直肠癌(hereditary non-polyposis colorectal cancer,HNPCC)中MSI的发生率高达86%,而在散发性结直肠癌中MSI的发生率也达16%。与此同时，陆续有研究者在结直肠癌中发现类似分子现象，与MMR系统功能缺陷密切相关，影响结直肠癌患者的生存时间。1997年，美国国家癌症研究所(National Cancer Institute,NCI)在结直肠癌的国际专题会议上，对MSI进行统一定义，即与正常组织相比，肿瘤组织中由微卫星重复单元的插入或缺失导致的微卫星长度改变称为MSI。同年，美国NCI在MSI研讨会对MSI检测位点的选择和诊断标准进行规范和统一，推荐了简称为“2B3D”的MSI位点检测Panel,称之为Bethesda Panel或NCI Panel,该Panel包括2个单核苷酸位点(BAT-25和BAT-26)和3个双核苷酸位点(D2S123、D5S346和D17S250)。同时，专家组也制定Panel判读标准：若5个微卫星位点中有2个或2个以上的微卫星位点不稳定，则为微卫星高度不稳定性(microsatellitein stability-high,MSI-H);若有1个微卫星位点不稳定，则为微卫星低度不稳定性(microsatellite instability-low,MSI-L);若5个微卫星位点均稳定，则为微卫星稳定(microsatellite stability,MSS)。2002年，美国NCI对MSI的检测进行修订和补充，推荐含有5个单核苷酸位点(BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-22和NR-24)构成的Pentaplex Panel,检测灵敏度远高于“2B3D”NCIPanel。2004年，美国Promega公司发布全球首个商品化MSI检测试剂盒；2006年，Promega Panel MSI检测体系出现，将Pentaplex Panel中的NR-22替换为MONO-27,包括5个单核苷酸位点(BAT-25、BAT-26、NR-21、MONO-27和NR-24)和2个对照位点(PentaC、PentaD)。目前，国内外权威指南和专家共识推荐MSI检测方法主要是2B3D Panel和Promega Panel。
2015~2017年，大量临床研究证实PD-1/PD-L1抑制剂对MSI-H/错配修复功能缺陷(deficient mismatch repair,dMMR)实体瘤患者疗效显著。2017年，美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)正式批准帕博利珠单抗用于MSI-H型晚期或转移性实体瘤患者的治疗。目前，MSI-H发生率高的实体瘤包括子宫内膜癌(20%~30%)、胃癌(15%~20%)和结直肠癌(12%~15%)。中国每年新增MSI-H患者人数近30万，美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network,NCCN)或中国临床肿瘤学会(Chinese Society of Clinical Oncology,CSCO)的最新指南，将MSI检测作为结直肠癌、子宫内膜癌、小肠腺癌和胃癌一线治疗方案的必要检测。此外，行林奇综合征筛查和接受免疫治疗的实体瘤患者均推荐行MSI检测。
3MSI的致病机制(MMR机制）
3.1MMR组成与功能
1964年，MMR系统阐述了细菌和酵母中的DNA切除－再合成过程，主要纠正在DNA中产生的错配核苷酸或插入－缺失环的复制错误。MMR基因的产物是MMR蛋白，属于核酸水解酶。DNA在复制过程中会不可避免地发生错误，而MMR系统起到负责监视和修正DNA复制和重组过程中的错误，使DNA能精确复制，保证遗传的保守性和稳定性。
MMR系统广泛存在于生物体内，在大肠埃希菌(esche-richia coli, E .coli)中发现MMR,即MutSLH依赖于MutS、MutL、MutH等基因编码的产物。在E.coli的DNA复制过程中，新生链上约256个碱基对出现1次GATC序列，在被合成后的短时间内不会被甲基化，而此时模板链上的GATC序列已被甲基化。该差异使模板链与新生链暂时得以区分，为MutSLH-MMR特异性识别提供前提和基础。MutS识别错配或未配对碱基并与之结合，MutL参与形成复合体“MutL-MutS-DNA”,并激活MutH的核酸内切酶活性，在错配位点附近(GATC)序列处将非甲基化的DNA链切割，然后核酸外切酶在解螺旋酶和单链DNA结合蛋白的协助下，将非甲基化的DNA序列从GATG位点至错配位点整段去除。
目前，真菌和哺乳动物体内的MMR系统也开始得到进一步探索。研究发现多个MMR相关分子，主要包括5个MutS同源体(MSH2、MSH3、MSH4、MSH5、MSH6)、4个MutL同源体(MLH1、MLH2/PMS1、MLH3、MLH4/PMS2)、MutH同源体和UvrD同源体。人类MMR系统中的主要蛋白包括MLH1、MSH2、MSH3、MSH6、PMS1、PMS2和MLH3,它们以异源二聚体的形式相互作用。MSH2与MSH6或MSH3偶联（分别形成MutSα和MutSβ复合物），2个异源二聚体均可识别新合成的DNA核苷酸链上的碱基错配，并与错配位点结合；MLH1与PMS2、PMS1或MLH3偶联（分别形成MutLα、MutLβ或MutLγ复合物），与结合到DNA链上的MutSα或MutSβ形成暂时性的复合物启动MMR,与有关的酶相互配合，切除含有错配碱基的1段DNA链，以代替被切除的DNA链，完成含错配碱基DNA核酸链的修复（图2)。
3.2MMR与MSI的关系
微卫星序列是DNA复制过程中最易发生错配的序列，需要MMR相关蛋白修复。MMR是高度保守的细胞过程，在DNA复制过程中起重要作用。有研究证实，MMR使DNA复制的准确性提高100~1000倍。若MMR功能缺陷，微卫星出现的复制错误得不到纠正并不断累积，使微卫星序列长度或碱基组成发生改变称为MSI。同时，导致基因组呈高突变表型，即MSI是MMR缺陷导致的结果，故可通过检测MMR蛋白缺失反映MSI状态。采用免疫组化法检测肿瘤样本中MLH1、MSH2、MSH6和PMS2表达，若4个MMR蛋白均阳性，则为错配修复功能完整(mis-match repair proficient, pMMR);任一MMR蛋白缺失即为dMMR。通常dMMR相当于MSI-H表型，pMMR相当于MSI-L/MSS表型，根据免疫组化检测结果可提示是否进行特定MMR基因的突变检测。
4MSI的临床意义
MSI最早在结直肠癌中发现，其在结直肠癌、胃癌和子宫内膜癌等多种实体瘤中高发,在林奇综合征筛查、化疗药物选择、预后预测和免疫检查点抑制剂获益人群筛选等方面具有重要意义。2021年，美国NCCN指南推荐结直肠癌、子宫内膜癌、胃癌和小肠腺癌的新确诊患者常规检测MSI,同时也推荐前列腺癌、胰腺癌等进行MSI检测以指导免疫治疗。CSCO结直肠癌诊疗指南推荐结直肠癌患者行MSI/MMR检测，《结直肠癌分子检测高通量测序中国专家共识》(2021)也将MSI/MMR列为“必须检测的生物学标志物”。《子宫内膜癌分子检测中国专家共识》(2021)推荐对子宫内膜癌MMR/MSI患者行林奇综合征筛查。MSI检测对结直肠癌和子宫内膜癌等多种实体瘤患者的治疗，均有重要的临床意义。
4.1MSI检测与林奇综合征的关系
林奇综合征是由MMR基因（包括MLH1、MSH2、MSH6和PMS2基因）胚系致病性突变，或EPCAM基因失活导致MSH2启动子高度甲基化，引起MSH2基因沉默所致的常染色体显性遗传性肿瘤综合征。林奇综合征发病时间早，约占结直肠癌发生率的3%,包括结直肠癌、子宫内膜癌、卵巢癌和胃癌等多种肿瘤。由于MMR基因的功能失活，微卫星出现的复制错误得不到纠正并不断累积，90%的林奇综合征患者表现为dMMR和（或）MSI-H表型。结直肠癌患者无论年龄和分期，行林奇综合征筛查均有助于发现疾病。《遗传性结直肠癌临床诊治和家系管理中国专家共识》推荐对MSI-H/dMMR的结直肠癌患者行MMR胚系检测，以明确诊断林奇综合征。
4.2MSI检测与5-FU类化疗药物的选择
MSI检测能够预测结直肠癌辅助化疗的疗效，2003年一项回顾性研究表明，MSI-H结直肠癌Ⅱ/Ⅲ期患者未从5-FU的单药辅助治疗中获益。2010年，Sargent等研究证实Ⅱ期MSI-H的结肠癌患者术后预后较好，患者未从5-FU单药化疗中获益，总生存期(overall survival,OS)缩短(HR=2.95)。国内外权威指南均指出，Ⅱ期MSI-H/dMMR的结直肠癌患者预后较好，不建议使用氟尿嘧啶类药物治疗。因此，Ⅱ期患者术后应常规行MSI检测以制定个体化治疗方案，MSI-H的结直肠癌患者应尽可能避免氟尿嘧啶的单药辅助治疗。
4.3MSI检测与预后分层关系
MSI检测对预测结直肠癌患者预后具有重要价值，MSI-H的结直肠癌患者有显著的病理特征，包括近端结肠优势、分化程度差、丰富的黏液成分和淋巴细胞浸润增加。MSI-H在结直肠癌患者发生率为15%,现有数据表明，MSI-H/dMMR是Ⅱ期结直肠癌患者的独立预后指标，与MSI-L/pMMR患者相比，其OS长和复发风险低。此外，MSI还可作为胃癌和小肠腺癌的预后因子。一项荟萃分析表明，MSI-H胃癌患者预后较好(HR=0.63),但MSI-H胃癌患者未从5-FU单药辅助化疗获益。在小肠腺癌中，与MSS患者相比，MSI-H患者预后更佳。
4.4MSI检测与免疫检查点抑制剂获益人群的关系
2017年，美国FDA批准PD-1抗体帕博利珠单抗，用于不能手术或转移的MSI-H/dMMR实体瘤患者的治疗，已成为首个不限癌种、仅以生物学标志物进行治疗选择的抗肿瘤药物。随后，Check Mate142研究表明,纳武利尤单抗治疗MSI-H/dMMR转移性结直肠癌患者的有效率为31%,中位无进展生存期(progression-free survival,PFS)为14.3个月。美国FDA批准纳武利尤单抗治疗MSI-H晚期结直肠癌患者。KEYNOTE-177研究表明，MSI-H/dMMR患者姑息一线应用帕博利珠单抗、标准化疗靶向治疗的客观有效率(objective response rate,ORR)分别为43.8%和33.1%,中位PFS分别为16.5和8.2个月，差异有统计学意义,晚期结直肠癌一线用药—帕博利珠单抗也再次获批，MSI跻身为一线治疗标志物。2021年，我国首款自主研发的PD-L1抗体恩沃利单抗经国家药品监督管理局(National Medical Products Administration,NMPA)获批上市，用于MSI-H/dMMR成人晚期实体瘤患者治疗，结直肠癌、胃癌和其他实体瘤患者的ORR为42.7%,疾病控制率为66.0%,抗肿瘤疗效佳，为患者增加新的治疗选择。总之，MSI-H/dMMR晚期结直肠癌患者可从PD-1/PD-L1治疗中获益，通过检测MSI状态可以预估免疫检查点抑制剂的使用价值。
5MSI的检测方法
5.1PCR+毛细管电泳技术
采用多重荧光聚合酶链式反应扩增(quantitive fluorescent polymerasechain reaction,QFPCR)结合毛细管电泳法，对微卫星位点和对照位点进行检测。当微卫星位点用于判定样本MSI状态，对照位点除作为内部质控外，还可用于验证肿瘤组织和正常组织是否来自同一个体。扩增体系中对每个检测位点设置2条引物，其中1条标记特定荧光基团。引物与对应的基因组DNA模板结合进行扩增，产生特定长度和荧光标记的扩增产物，扩增产物用毛细管电泳检测，通过特定长度的产物可以判定特定位点重复单元的重复状态。
目前，PCR+毛细管电泳技术是MSI检测的公认“金标准”。首先检测时分别提取肿瘤样本和对照样本的DNA,其次使用试剂盒对正常组织和肿瘤组织的DNA进行PCR扩增，采用基因分析仪进行DNA片段分析，比较肿瘤组织和对照组织中各微卫星位点的电泳图峰型和数目，判断肿瘤组织相应位点的不稳定状态。
为避免PCR实验室污染，建议选用含有尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)防污染MSI检测体系,在PCR扩增前消化可能存在含有尿嘧啶的扩增产物，保证实验结果的准确性。
5.1.1位点选择
目前，本文推荐选用已通过NMPA或FDA注册审批要求的试剂盒位点组合，如：(1)BAT-25、BAT-26、D2S123、D17S250和D5S346;(2)BAT-25、BAT-26、NR-21、NR24、MONO-27和NR-27;(3)BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24和MONO-27。同时为保证结果的准确性，可增加对照位点作为内部质控，常见对照位点为PentaC、PentaD和Amel等。
5.1.2检测流程
检测流程包括：DNA提取、PCR扩增、毛细管电泳分离样品和结果分析。
5.2PCR+高分辨率熔解曲线法
除多重荧光PCR结合毛细管电泳法外，也可使用PCR结合高分辨率熔解曲线法检测相关MSI标志物。高分辨率熔解曲线法通过在反应体系中加入饱和DNA双链荧光染料，PCR结束后进行DNA双链产物升温解链反应获取荧光信号。随着温度升高，DNA双链氢键不断被打开，荧光染料释放，荧光强度逐渐降低。不同核酸片段有特异性温度，即荧光强度变化曲线（又称熔解曲线）。总的DNA双螺旋结构降解一半的温度称为熔解温度(Tm),不同序列DNA的Tm值不同。DNA中G-C含量与Tm值成正比，G-C含量越高，Tm值越高。高分辨率熔解曲线法通过比较不同样本之间熔解曲线的位置和形状上的差异，区分基因的分型。
熔解曲线技术被认为是最适合分辨单碱基的差异，因为饱和染料的使用，显著提高了高分辨率熔解曲线法在单碱基突变、小片段插入／缺失方面检测的灵敏度和分辨率。PCR结合高分辨率熔解曲线法检测相关MSI单态性生物学标志物，该标志物一般为8~12个A或T碱基的单碱基重复序列（均聚物），分布在多个基因中。在正常细胞（即MMR功能正常的细胞）中碱基数目保持稳定（如11个）。在MMR功能缺陷的细胞（如癌细胞）中，这些均聚物更易变，并且通常观察到1或2个碱基对的删除，将长度为11的均聚物与长度为10的均聚物用于鉴别MMR的缺陷。
5.2.1位点选择
Zhao等对MMR缺陷的肿瘤行全基因组测序(whole genome sequencing,WGS)分析，发现59个单核苷酸微卫星位点对MSI检测具有代表意义，其中50个位点位于非翻译区，提示组织特异性好。59个均聚物长度≤12bp,与PCR技术和NGS技术都能较好地兼容。
目前，有2组较为成熟的标志物组合：(1)ACVR2A、BT-BD7、DIDO1、MRE11、RYR3、SEC31A和SULF2;(2)EIF4E3、IFT140、PPP1CC、UBAC2、PRR5-ARHGAP8、ACVR2A、TAOK3和RBM14-RBM4。
5.2.2检测流程
5.3NGS检测
MSI状态可应用WGS、全外显子组测序(whole exon sequencing,WES)或靶向测序(targeted gene sequencing,TGS)等NGS技术进行检测。美国NCCN结直肠癌临床实践指南(2022)推荐可使用经验证的NGS Panel进行MSI检测，尤其适用于需RAS和BRAF基因分型的转移性结直肠癌患者;美国NCCN小肠腺癌临床实践指南(2023)中MSI检测仅推荐经验证的NGS Panel。《结直肠癌及其他相关实体瘤微卫星不稳定性检测中国专家共识》(2019)、《结直肠癌靶向治疗中国专家共识》(2022)和《中国结直肠癌肝转移诊断和综合治疗指南》(2023),亦推荐可通过经验证的NGS法进行MSI检测。NGS检测MSI的优势：可覆盖大量的微卫星位点，根据Panel设计不同，可检测五至数十万个的微卫星位点，可针对特异性肿瘤或泛肿瘤选择不同的位点组合，对MSI状态的评估更加全面。
目前，NGS开发的Panel主要根据两种检测原理，通过不同的算法来检测MSI。(1)通过比较肿瘤样本与正常对照样本（或正常人的基线水平）之间的微卫星重复序列长度分布，以不稳定位点比例是否超过既定阈值来判断微卫星状态。如MSI-sensor使用成对的肿瘤和正常WES数据，比较单核苷酸到五核苷酸重复微卫星的等位基因长度分布，并对每个分析的基因座应用χ2分析，给出对应于不稳定微卫星基因座百分比的MSI得分，阈值为3.5%。MSI-Colon Core中微卫星状态由样本中不稳定基因座与正常基线水平的百分比来确定，阈值为40%。(2)基于序列中的突变负荷和（或）微卫星中的突变负荷判断MSI状态，如MSI-seq Index是基于RNA测序数据和两个测量值(PI-微卫星中的插入占RNA转录本中所有插入的比例；PD-微卫星中的缺失占RNA转录本中所有缺失的比例）的比率检测MSI状态，MSI-H的PI/PD比值<0.9。Nowak等使用275个与癌症相关的基因定向测序数据，把总突变负担(>40Mb)和单核苷酸微卫星中的INDELs(>5Mb)定义为MSI-H。NGS平台的MSI算法包括但不限于MSI-sensor、MSI-ColonCore、MSI-seqIndex和Nowak等，随着NGS的不断发展，将陆续开发出更多新算法，不断提高NGS检测MSI的准确度和敏感度。
临床和病理医师对无法获取肿瘤组织的患者，可使用外周血循环肿瘤DNA(circulating tumorDNA,ctDNA)进行MSINGS检测由于液体活检诊断的准确性和灵敏度有限，目前不推荐常规行ctDNA的MSINGS检测，仅作为无法获取肿瘤患者评价MSI状态的替代检测。
6检测的样本类型与要求
6.1肿瘤活检或手术的新鲜标本
6.2福尔马林固定石蜡包埋标本
6.3石蜡切片数量要求
6.4血液标本
根据不同Panel检测要求选择合适抗凝剂的采血管或专用保存管，血液标本的采集、运输和保存应严格按照相关操作流程进行，血液标本应在采集2h内完成处理，避免反复冻融，防止核酸降解。
6.5核酸样本用量
提取的基因组DNA可通过紫外分光光度仪或Qubit等检测浓度，必要时对DNA样本进行浓度调整和稀释，确保单个PCR管中DNA的上样量为10~250ng。提取DNA样本于2~8℃保存7天内检测，于-20℃保存6个月内检测。
本文建议使用Qubit检测DNA浓度，由于提取的DNA样本中混有不同比例RNA,紫外吸收法可能高估样本中DNA的浓度，Qubit检测加入DNA染料可准确检测DNA浓度。
7质量控制
标本的质量控制在检测的前、中、后各过程中应注意以下几点：(1)待测样本需病理医师进行可行性评估，一般肿瘤细胞比例＞20%,细胞学样本中肿瘤细胞数＞200个。必要时可宏观解剖或显微切割富集肿瘤细胞；(2)需有独立的切片设备和场地，使用一次性刀片、棉签和漂片液，避免切片时样本之间的交叉污染；(3)PCR+毛细管电泳法检测MSI分子量内标需合格，采用经试剂盒配套验证的分子量内标，各片段大小标注正确；如采用其他外配分子量内标则需进行验证，保证无明显荧光渗透现象；(4)微卫星位点检测峰高，未出现超阈值(3500/3500xl、3500Dx/3500xLDx、GenReader7010,峰高<30000;3130xl,峰高<8000);反之，应调整产物稀释比例重新检测，可取PCR产物≥2μL用纯化水稀释2~40倍，将稀释后的产物进行毛细管电泳分离；(5)待检测位点和内参位点引物荧光基团标记及其产物片段大小，符合预期；(6)空白对照以无核酸酶纯水为模板进行扩增，无任何扩增产物；(7)以质控品为模板进行扩增，所有质控内参位点有效峰位置与预期相差<2nt;(8)每个对照位点至少出现1个不低于100RFU的产物峰，核实同一组肿瘤样本和对照样本的对照位点是否一致；每个微卫星位点至少出现一组连续峰，其最高峰≥100RFU;(9)采用NGS检测MSI的Panel,应做好实验操作和生物信息等信息确认；(10)文库的质量是影响NGS数据的关键，建议使用荧光定量或其他准确性高的方法鉴定，实验中需设置阴阳性监控整个实验流程；根据测序深度、测序覆盖度、数据产出和运行时间等选择合适的NGS测序平台，并做相应指标的质控标准；(11)实验操作、生物信息分析和报告分析等人员应取得上岗资质，参加必要的培训；(12)进行月度或季度的数据统计，分析MSI-H的频率与文献报道是否相符；(13)实验室应定期参加相应的室间质评或选择同级别或高级别的实验室，进行室间比对。
8结果判读和报告模板
PCR+毛细管电泳技术和PCR+高分辨率熔解曲线法的结果判断：出现2个及以上不稳定的核苷酸重复位点时，判定为MSI-H;出现1个或未出现不稳定的核苷酸重复位点时，判定为MSI-L/MSS。
目前，采用NGS检测MSI的结果判断尚缺乏统一标准。各实验室需根据不同检测平台和Panel的性能确认设定MSI阳性阈值。
实验室出具的报告内容除患者基本信息外，还需体现组织学病理诊断结果、肿瘤细胞含量、DNA质控信息、检测方法、检测位点、检测结果、检测结论、结果解释、注意事项（可描述检测技术的局限性、相关注意事项）和参考文献等（表1)。若采用NGS检测MSI状态，则需另外注明测序质量评估指标。
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