射血分数保留型心衰（heart failure with preserved ejection fraction，HFpEF）是指左室射血分数≥50%的心力衰竭，特征是左室等容舒张延长、左室僵硬度增加、左室舒张末压增加和左室充盈缓慢[1]。HFpEF是一个具有高发病率和高死亡率的紧迫临床事件[2]，已经成为一个主要的公共健康问题，其患病率现在已经超过了射血分数降低型心衰（heart failure with reduced ejection fraction，HFrEF）[3]。HFpEF患者的预后较差[4]，到目前为止，没有任何治疗显示可以有效降低其发病率或死亡率[5]，成为国际医学研究的难点和热点。
内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）/一氧化氮（nitric oxide，NO）/环磷酸鸟苷（cyclic guanosinc monophosphate，cGMP）/蛋白激酶G1（protein kinase G1，PKG1）通路在防止心肌损伤、心室重塑和心肾综合征方面起着重要作用[6]，该通路的损伤是HFpEF的病理生理学基础。cGMP及其主要靶激酶PKG是公认的心脏功能和慢性应激反应的调节剂，介导NO和利钠肽的生理功能，在心血管系统的维持中发挥重要功能：它们的增强能够引起心肌制动，减少不适应性肥大，增强细胞存活信号和线粒体功能，防止缺血/再灌注损伤，并减弱儿茶酚胺的刺激作用[7-8]。激活cGMP/PKG信号通路已成为治疗心力衰竭的有效治疗策略[9]，可能成为HFpEF治疗的一个新靶点[10]。
中医脉络学说理论指导下研制的芪苈强心胶囊是治疗慢性心衰的代表中成药，循证医学研究证实其治疗慢性心力衰竭的安全性及有效性[11-12]。前期临床研究报道芪苈强心胶囊对HFpEF患者临床症状和中医证候评分、明尼苏达心力衰竭生活质量量表（MLHFQ）评分、6 min步行试验（6WMT），E/E’值、左房容积指数（LAVI）、左室舒张期充盈速度比值（E/A）均有明显改善，提高患者的生活质量[13]。芪苈强心胶囊是首个进入《舒张性心力衰竭诊断和治疗专家共识》的中成药[14]，然而其治疗HFpEF的基础研究及机制探讨尚未完全开展。
本研究基于网络药理学方法[15]对芪苈强心治疗HFpEF的关键靶点和信号通路预测，采用醋酸脱氧皮质酮（deoxycorticosterone acetate，DOCA）-盐敏感性高血压大鼠建立HFpEF模型，通过体内实验验证网络药理学的预测结果，以探索芪苈强心胶囊治疗HFpEF可能的作用机制。
一、网络药理学预测与分析
1 芪苈强心胶囊治疗HFpEF的网络分析结果及靶点预测
44个活性成分（表1）在Swisstargetprediction和Pharmmapper平台上共得到（去除重复值）530个潜在作用靶点；在OMIM、DisGenet、GenCard数据库中检索“射血分数保留型心衰”“HFpEF”“舒张性心衰”，3者取并集，去除重复值共得到672个作用靶点。利用Venn图在线平台得到药物和疾病共同作用靶点38个，见图1。
将38个共同靶点输入STRING 11.0在线平台得到的药物-疾病靶点PPI网络，共得到51条边，平均节点度2.68。通过Cytoscape 3.7.2内置Network Analyzer插件进行PPI网络拓扑分析。其中，发现网络中较为重要的靶基因与G蛋白偶联受体、内皮素受体、β肾上腺能受体相关。
2 GO功能及KEGG通路富集分析
借助Metescape分析平台，共得到芪苈强心胶囊作用于HFpEF治疗的499个生物过程，30个细胞成分，31个分子功能。筛选P＜0.01排名前10的GO注释结果做柱形图展示如图2。根据分析结果，芪苈强心胶囊可能参与调控了血液循环、循环系统、心脏收缩等生物过程；在膜筏、轴突、细胞质区等细胞组分中起作用；激活了α-葡萄糖苷酶活性、内肽酶活性、水解酶活性等分子功能。
KEGG共富集到52条通路，按照P＜0.01，富集值≥1.5筛选前20条通路结果如图2所示，芪苈强心胶囊治疗HFpEF的潜在途径可能为cGMP-PKG信号通路、心肌细胞中的肾上腺素能信号传导、神经活性配体受体相互作用、cAMP信号通路、肾素分泌、钙信号通路等。其中富集度最高的cGMP-PKG信号通路是HFpEF治疗的重要靶点[18]，本研究选用该通路进行体内实验验证探讨芪苈强心胶囊治疗HFpEF的作用机制。
3 网络可视化分析
应用Cytoscape 3.7.2软件对QLQX有效成分，疾病-药物共有的38个潜在靶基因、生物过程、KEGG通路进行可视化网络构建，如图3所示。该网络说明芪苈强心胶囊通过多组分、多靶点、多环节发挥对HFpEF的治疗作用。
二、 实验验证
1 各组大鼠一般状态变化情况
对照组大鼠一般状态良好，毛色光泽、行动敏捷、饮食及饮水量正常，尿量正常；模型组精神状态欠佳，毛色粗糙，无光泽，行动迟缓，饮水量增多，尿量增多；各给药组大鼠精神状态及一般状况有所改善。如表2所示，经药物干预8周后，与对照组相比，模型组心脏质量和心脏指数均明显提升（P＜0.01）；与模型组相比，各给药组心脏质量和心脏指数均显著降低（P＜0.01）；各组大鼠体质量无明显差异。
2 芪苈强心胶囊对DOCA盐敏感型HFpEF大鼠心功能影响
如图4和表3所示，与对照组比较，模型组大鼠EF显著降低（P＜0.05），LVAW、LVPW显著升高（P＜0.05），提示心室壁肥厚，心功能下降；IVRT时间延长、E/A值下降（P＜0.05），提示舒张功能障碍，EF尚处于正常范围，IVCT无明显差异，表明收缩功能未明显损伤。沙库巴曲缬沙坦组EF较对照组明显降低（P＜0.05），也处于正常范围；LVAW较模型组降低（P＜0.05），E/A比值显著提升（P＜0.01）；各组LVIDs、LVIDd无统计学差异，提示心室未增大。芪苈强心胶囊低剂量组EF、E/A值较模型组升高（P＜0.05），未能降低室壁厚度。芪苈强心胶囊高剂量组较模型组明显提高EF，IVRT时间缩短，E/A值提升（P＜0.05），提示心室舒张功能明显恢复，同时LVAW、LVPW降低（P＜0.05），减轻了室壁肥厚程度。
3 芪苈强心胶囊对DOCA盐敏感型HFpEF大鼠血清NO、cGMP水平的影响
如图5所示，与对照组相比，模型组大鼠血清NO和cGMP水平均显著下降（P＜0.05、0.01）；与模型组相比，沙库巴曲缬沙坦组血清NO水平显著升高（P＜0.05），芪苈强心胶囊低、高剂量组血清NO和cGMP水平均显著升高（P＜0.05）。
4 大鼠心肌组织eNOS和CD31免疫荧光染色
内皮功能障碍被认为是HFpEF病理生理学的中心机制[19]。如图6所示，绿色荧光为eNOS，红色为CD31，二者均为内皮细胞标志物，共表达处呈现黄色。如图7所示，与对照组相比，模型组大鼠心肌组织血管周围eNOS荧光表达量显著降低（P＜0.01），而各给药组均能明显恢复大鼠心肌组织内皮功能（P＜0.05），芪苈强心胶囊高剂量组效果更为明显（P＜0.01）。
5 芪苈强心胶囊对心肌组织eNOS、PKG1、PDE5A、SERCA和sGCα蛋白表达的影响
如图8和表4所示，与对照组相比，模型组大鼠心肌组织eNOS、PKG1和SERCA蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05、0.01），PDE5A蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），sGCα蛋白表达水平降低但无统计学差异；与模型组相比，沙库巴曲缬沙坦组eNOS、SERCA、sGCα蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05），PDE5A蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；芪苈强心胶囊低剂量组eNOS、PKG1、sGCα蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05、0.01），PDE5A蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；芪苈强心胶囊高剂量组eNOS、PKG1、SERCA和sGCα蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05、0.01），PDE5A蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。
6 芪苈强心胶囊对心肌组织BNP和β-MHC mRNA表达的影响
如图9所示，与对照组相比，模型组心肌组织BNP和β-MHC mRNA表达水平均显著升高（P＜0.05、0.01）；与模型组相比，各给药组心肌组织BNP和β-MHC mRNA表达水平均显著降低（P＜0.05）。
三、 讨论
HFpEF与左室舒张功能障碍密切相关，舒张功能障碍可由肥厚和间质纤维化导致的左室僵硬度增加以及钙循环受损导致的左室舒张异常引起[20]。内皮炎症及其继发的内皮功能障碍被认为是HFpEF其重要病理机制[21]。肥胖、糖尿病、高脂血症等全身促炎状态可导致冠状动脉微血管内皮炎症，其级联反应始于内皮细胞，通过抑制eNOS使内源性NO生物利用度降低，继而影响cGMP含量及其下游PKG活性。这种低活性造成肌浆网上受磷蛋白和SERCA-2a活性降低，使Ca2+在肌浆网中积累，心肌无法正常松弛，继发心肌细胞僵硬，舒张功能障碍。
中医将心衰归于“心积”“心水”等范畴，脉络学说提出，心积、心水病机多为宗气亏虚，心气虚乏，营卫交汇生化障碍为本，营卫气化失常瘀血阻滞脉络津聚为水为主要病理过程[22]。宗气亏虚，心脏气阳虚乏、脉道无力，血无以运而形成脉络瘀阻，同时营卫交汇生化失司，阳虚不能化水，致使水饮停滞，气、血、水三分合而发病，痰瘀互结，阻滞脉络，导致络息成积的的病理变化，可引起心脏组织肿大变形，室壁肥厚、纤维增生，致使心脏扩大和重塑，心功能恶化。
脉络学说将HFpEF病机归纳为“气阳虚乏、络瘀水停、络息心积”，在“络以通为用”治疗原则指导下，进一步提出了“益气温阳、活血通络、利水消肿”治法并研制了芪苈强心胶囊。本药以黄芪、附子、人参、陈皮益气温阳，丹参、红花活血通络，葶苈子、香加皮、泽泻、玉竹利水消肿，桂枝佐使以辛温通络，温阳化气，诸药配伍使心慌气短、不能平卧、尿少水肿诸症自消，抑制心室重构，改善心脏功能，对HFpEF有较好的疗效[23]。
本研究采用网络药理学方法，通过公共数据库对芪苈强心胶囊明确鉴定的成分及HFpEF的共同作用靶点，利用生物信息学技术进行网络构建，寻找芪苈强心治疗HFpEF的可能作用靶点。既往亦有研究[24-26]通过网络药理学方法探究芪苈强心胶囊的作用机制，而所探讨的疾病多为慢性心衰（HFrEF）、糖尿病性心肌病、充血性心力衰竭等，尚无HFpEF的网络药理学研究；同时，这些研究多通过TCMSP、BAT-MAN TCM等平台直接检索芪苈强心胶囊中11味药物所有成分的各自靶点，未通过药物代谢研究探索其在体内真正发挥药效的物质成分，缺乏针对性，本研究弥补了这一缺陷。本课题组前期对芪苈强心胶囊11味药材通过自建化合物数据库完成对其化学成分的全面检识，共发现包括黄酮类22种、二萜生物碱33种、三萜皂苷类44种，苯丙素类21种，其他类化合物11种，其中44个化合物利用对照品进行了确认[17]，又确认了毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、杠柳苷G等成分为芪苈强心胶囊强心、利尿及扩血管的重要活性成分[27]。
芪苈强心胶囊组方中黄芪、附子、人参、陈皮益气温阳，助阳化气，针对气阳虚乏的基本病机，本研究中鉴定的主要有效成分包括黄芪甲苷、异鼠李素、新乌宁碱、次乌头碱、人参皂苷、橙皮苷等，具有非正性肌力洋地黄类作用，能改善心肌收缩、扩血管、增加细胞搏动频率和幅度、改善心功能[28]；丹参、红花活血化瘀以通脉络，主要有效成分包括丹酚酸、丹参素钠、丹参酮、毛蕊异黄酮、槲皮素等，可扩张冠状动脉、减少红细胞聚集、改善血黏度和血液流变等[29]；泽泻、葶苈子、香加皮、玉竹养阴利水消肿以缓其症，主要有效成分包括泽泻醇、异鼠李素、杠柳毒苷、槲皮素-吡喃葡萄糖等，具有强心、利尿、抗炎、免疫调节等多种生物功能[30]。这些药理作用为芪苈强心胶囊治疗HFpEF奠定了基础。
KEGG通路富集结果显示，cGMP-PKG信号通路为芪苈强心胶囊治疗HFpEF的高敏感通路，对此本研究进行了深入探讨。NO-sGC-cGMP-PKG轴被描述为心脏舒缩的重要调节器[31]。在生理条件下，内皮细胞在一级联反应中的关键作用是通过eNOS的活性生成NO，并激活sGC作为其靶细胞（如心肌细胞和血管平滑肌细胞）中的气体递质。作为回应，sGC产生cGMP，这是下游效应器PKG酶的关键调节因子，能够调节血管紧张、松弛和收缩[32]。
该系统的4个基本调节因子是磷酸二酯酶（GMP-binding cGMP-specific phosphodiesterase，PDE），PDE5A对cGMP分子具有特异性能够将cGMP降解为5′-GMP，如果PDE上调加上增强的硝基氧化应激，可能显著导致HFpEF患者心肌中cGMP-PKG信号受损[33]。舒张功能障碍还可能由于该通路中SERCA-2a活性降低有关，导致肌浆网清除Ca2+功能降低，舒张期Ca2+增加，心肌松弛异常[34]。总的来说，cGMP增加和PKG激活导致细胞内游离钙减少，导致血管平滑肌细胞松弛，这是该通路主要生理效应之一。
常丽萍[35]研究发现芪苈强心胶囊可以提高心梗后心衰大鼠主动脉组织中降钙素基因相关肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）、cGMP、eNOS蛋白表达，同时增强主动脉组织sGC、PKG mRNA表达水平，提示芪苈强心胶囊可以通过舒张血管而增强心肌供血，其扩展血管机制可能与eNOS-sGC-cGMP-PKG通路相关，证实了芪苈强心胶囊可以通过调控cGMP-PKG通路改善心脏/血管舒张功能。
本研究亦证实，芪苈强心胶囊能降低HFpEF大鼠心脏指数，提高EF，降低室壁肥厚程度，缩短IVRT时间，提高E/A值，提示心室舒张功能明显恢复；同时增加HFpEF血清中NO水平，提高eNOS表达量，增强内皮功能；可降低PDE5A对cGMP的水解作用增加心脏cGMP水平，同时增强PKG活性，这些过程改善了肌丝功能，降低了心肌细胞的被动僵硬度，从而改善了舒张功能。此外，芪苈强心胶囊还能降低该通路下游心肌肥厚相关因子BNP和β-MHCmRNA相对表达量增加，提示其能够增强大鼠排钠利尿和血管平滑肌松弛，改善心室重构的重要作用。
综上所述，本研究基于网络药理学构建“药物-有效成分-靶点-疾病”网络，阐明了芪苈强心胶囊多组分-多靶点-多环节治疗HFpEF的作用机制。通过体内实验，发现芪苈强心胶囊可以多维度、全面的激活cGMP-PKG信号通路，增强内皮功能，改善心肌被动僵硬程度，增强Ca2+转运功能，减轻心室重构，验证了网络药理学的预测结果。这些数据对于阐明芪苈强心胶囊介导的舒张性心功能障碍改善的潜在机制有重要意义，并为HFpEF治疗提供了有力佐证。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：郝佳梦，常丽萍，王 璐，刘 焕，陈 檬，侯 斌，周璐恒，侯云龙．基于网络药理学及实验验证探究芪苈强心胶囊治疗射血分数保留型心衰的作用机制 [J]. 中草药, 2022, 53(14): 4365-4375 .
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