支架如何抗血栓？
前言
WHO估计到2030年全世界将有大约2300万人死于心血管疾病。近年来心血管领域的器械治疗迅速发展，其中各种装置包括人工心脏瓣膜、血管支架、血管移植物、心室辅助装置构成重症患者的最后生命防线。这些装置由各种生物或金属材料组成，通常不会引起任何炎症或免疫反应。然而，这些生物材料的血液相容性是一个值得关注的问题，由这些生物材料制成的设备在与血液接触时可能会产生不必要的凝血反应。血液凝固后可能出现血流动力学不稳定、出血并发症和器官损伤等后续问题，最终可能危及患者的生命。
目前，抗凝血和抗血栓药物在内的一些措施被用于降低栓塞风险，然而，这些药物可能会增加内出血的风险。
贯穿人体血管系统的天然内皮层提供了抗凝血表面。因此，在心血管装置的血液接触表面构建单层内皮细胞(ECs)被认为是解决这种血栓形成风险的最有效手段。
前两篇写了常用的心血管器械材料，通用的促内皮化技术，接下来让我们看一下这些技术如何去验证，在具体的器械中如何实现。
评估方式
心血管装置表面的内皮化可以通过三个连续步骤进行评估，分别是初始体外评估，相关模型的体内疗效评估，和非人类灵长类动物临床前评估。
体外
体外细胞培养模型可以非常方便的验证各种影响因素，包括细胞类型、机械和化学性质、血流动力学和药理学、内皮化策略的有效性等等。
天然内皮中的内皮细胞呈细长的鹅卵石状，排列方向与血流方一致，每个内皮细胞与周围的细胞结合形成连续的内皮单层。内皮化是防止血栓的重要措施，在人体植入心血管装置后，EPCs、单核细胞和血小板等各种血液循环细胞与装置接触，粘附在装置上。具体的细胞类型取决于装置表面的物理、化学和生物特性。在体外研究中，首先要进行表面工程的有效性测试，不同时间点的细胞粘附可以测试表面工程和细胞工程的效果，先用不同的免疫荧光染料标记来区分不同类型的细胞，再将ECs/血液外生内皮细胞和血小板共同培养在器械表面，通过贴壁细胞成像来观察。
扫描电子显微镜可以看到心血管装置表面发育的内皮层的形态。对样本横截面进行组织学或免疫组织化学染色，可获得器械表面内皮层的横截面图像，证实内皮层的连续单层结构。用共聚焦显微镜对免疫荧光染色的图像栈进行三维重建，可以确认ECs在器件表面形成粘附连接。改进的Häutchen En face法可用于观察内皮层的形态。
在细胞溶液培养基中，也可以培养植入后吸附在生物材料表面的各种血浆蛋白，包括白蛋白、球蛋白和纤维蛋白原，或者可以对血浆蛋白与表面的粘附进行单独的研究。血液相容性问题可以见参考文献6，其中的ISO 10993-4中介绍了体外血液相容性分析的具体过程与标准。
内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞，亦称为成血管细胞(angioblast)，在生理或病理因素刺激下，可从骨髓动员到外周血参与损伤血管的修复。1997年，Asahara等首次证明循环外周血中存在能分化为血管内皮细胞的前体细胞，并将其命名为血管内皮祖细胞。体外内皮化研究用到的EPCs需要从外周血中收集并培养来扩增数量，培养产生的二级EPCs群体称为BOECs，BOECs在内皮单层的表面标记，基因表达和形态方面与成熟ECs相似。虽然利用祖细胞分化成内皮细胞这种细胞转化的方式有利于体外研究，但实际应用到人体过程中会产生一些问题，比如粘附在器械表面的EPCs在体内向ECs的分化会同时激活体内其他循环细胞。
另外，静态体外培养缺乏适当的血液动力学刺激，包括体内环境中的压力、拉伸和应力。然而在动物模型中，细胞培养和血流动力学刺激的实验因素都不能被人为控制。此外，出于实验目的，各种药理学药物不能在动物模型中施用。一种体外动态培养系统可以解决这种问题，它包含细胞培养装置和搏动复制器/搏动灌注装置，系统产生的剪切应力可以模拟体内环境，让内皮细胞形成适当的黏着斑。
每种模型在设备测试中都有优点和缺点，这里只提到每种心血管设备的最佳或最常用的模型。
测试EC粘附强度能够确认内皮层在生理环境中的是否能粘附存活。可以通过将表面覆盖内皮的装置放置在具有脉动泵的剪切力的设备中来测量。完整粘附细胞的数量、时间和剪切应力数据将检验内皮层在生理环境中的生存能力。在内皮层功能检测中，e-NOS免疫染色可证实内皮层中是否存在e-NOS。粘附细胞的细胞功能可通过实时RT-PCR、ELISA和流式细胞术技术测定。
体内
尽管体外动态细胞培养系统足以提供血流动力学刺激，但它不能完全模拟体内的生化和生物刺激，这些刺激会影响生物分子和细胞在器械表面的粘附以及驻留细胞的表型。
小型动物价格低廉，如大鼠和兔子，但心血管解剖结构和血流动力学与人类并不相似。所以，猪、羊和犬大型动物如猪、羊和犬多用于内皮化评价。下面提到每种心血管设备的最佳或最常用的动物模型。
心脏瓣膜置换术的评价，目前认为羊是最好的动物。羊心脏的解剖结构和心率、血压等生理参数与人的心脏相当。成年绵羊的心脏瓣膜大小也与人类相当，而且羊模型的生长速度一般低于猪模型，术后可以保留一段时间，使得羊模型更适合于组织工程瓣膜的内皮化评估。
猪目前被认为是评估血管支架的最佳模型。猪的血管解剖结构，血管系统的生理和凝血系统与人类非常相似。在猪模型中损伤或植入后形成的新内膜的特征也与人类相似，使猪成为血管支架内皮化评价的合适模型，也被认为是血管移植物内皮化评估的最佳模型。
在体内研究中，可以通过钢丝或导管活检收集内皮层，然后对收集的细胞应用ELISA和流式细胞术等基于细胞的评估技术来评估EC的功能。超声等非侵入性成像技术可用于术后不同时间点的血流评估(有无闭塞)。解剖后，器械表面的内皮化可以按照前面体外部分提到的技术进行评估。
临床前
不同种类的狒狒是评估心血管装置的非人灵长类动物模型。它们在遗传、代谢和生理上与人类相似，灵长类动物的试验决定了装置是否可以进入下一阶段，即临床试验中。
主要心血管装置的内皮化
心脏瓣膜
1、机械心脏瓣膜
机械瓣膜双瓣叶的内皮化非常具有挑战性，双叶的表面不能模仿天然心脏瓣膜的弹性和生物学特性。而且面积大的，血流剪应力较高。双瓣叶连续地打开关闭，不与任何组织表面直接接触，但细胞可以从其他组织表面迁移到双叶表面。瓣叶表面的凝血始于蛋白质吸附，随后循环中血小板粘附在接触表面。在瓣膜表面涂覆抗血小板粘附材料，如聚乙二醇或肝素，由于涂层材料从机械瓣膜表面不断释放，只能在短时间内阻止血小板粘附。
生物材料的表面修饰，如纹理或蚀刻是另一种减少血小板粘附的技术，尽管该技术在体外显示出一些积极的结果，但其在体内的成功可能有限。类似的尝试是用亚微米柱结构对生物材料表面进行纹理处理，或者使用其他心血管装置的金属生物材料的纹理形态，制作产生紧密粘附和血液相容的生物衬里。
尽管应用了不同的人工内皮化技术，包括通过纹理和蚀刻对生物材料进行表面修饰，以及抗凝药物的固定化，但在体内用连续的长期功能性内皮层覆盖表面是不可能的，在没有任何融合的内皮单层的情况下，血小板粘附会非常快速。这一现状鼓励研究人员在瓣膜置换前，在瓣膜表面开发体外生成的内皮细胞单层。在机械阀的热解碳包被的双瓣叶上直接培养细胞，静态培养显示细胞增殖。然而，对于生成的内皮层在真实生理环境(主动脉或肺)中的存活，还需要进一步的改进。机械瓣膜的特殊区域，如靠近瓣叶边缘和铰链的区域，需要特别注意内皮层的发育，防止这些区域血栓的形成。
经过几十年的努力，也有公司开发过一些非血栓性机械瓣膜，结果并没有对抗凝产生任何积极的影响。迄今为止，机械瓣膜患者仍需要定期服用抗凝药物。
2、生物瓣膜
由于存在毒性(细胞水平)固定物，生物瓣膜在植入后不会很快内皮化。但在植入很长时间(超过一年)后，几乎所有生物假体瓣膜的尖端基底区和环区都观察到内皮细胞的存在。体外处理内皮化的生物瓣膜在体内表现出更多的EC黏附。这些观察结果表明，生物假体瓣膜中的有毒物质阻碍了EC的粘附。因此，在任何内皮化试验之前，这些瓣膜都需要先解毒处理。
对戊二醛固定的猪心包进行解毒，并用可生物降解的甲基丙烯酸硫酸软骨素水凝胶进行处理。然后用ECs培养处理后的心包，通过在心包上灌注血液来检测其凝血情况。未见血栓形成。用10%醋酸或8%谷氨酸处理戊二醛固定心脏瓣膜，使瓣膜脱毒，并与ECs培养，然后植入降主动脉。整个瓣膜表面可见合流的内皮层，未见新生内膜形成。
除解毒外，可以通过化学/生物手段对生物瓣膜进行表面修饰促进内皮化。生物瓣膜通过光氧化来防止对异种组织的免疫原性反应，减弱的免疫反应可能会减少血小板对异种组织的粘附，从而减少血栓形成。在另一项研究中，涂有纤维连接素-肝素和bFGF或EC生长补充剂(ECGS)的生物假体瓣膜内皮化效果很好。将ec培养的去细胞瓣膜置于受控动态环境中，通过细胞排列和均匀扩散，瓣膜的抗血栓特性得到改善。由小肠粘膜下层构建的经抗体处理的瓣膜显示出体内内皮化。采用LHydroM工艺处理猪瓣膜，并将其植入幼年羊的二尖瓣位置。治疗有助于诱导自发性内皮化，并伴有强附着。
生物瓣膜内皮化的技术目前大多数停留在动物阶段，离临床成功还很遥远，期待后续的其他技术实现。
组织工程瓣膜
这里需要先提一下组织工程的概念，随着细胞生物学、分子生物学、生物工程和材料科学的进步，20世纪80年代末90年代初，诞生了“组织工程学”，为再生医学的崛起开辟了崭新的道路。
组织工程学是应用工程学、生命科学和材料学的原理与方法，将在体外培养、扩增的功能相关的活细胞种植于多孔支架上，细胞在支架上增殖、分化，构建生物替代物，然后将之移植到组织病损部位，达到修复、维持或改善损伤组织功能的一门科学。
通过实验室将人体某部分的组织细胞进行体外培养扩增，然后把培养细胞种植和吸附在天然或人工合成的细胞外基质（支架）上，经过一段时间的培养后，一并移植到人体所需要的部位，形成正常结构和功能的组织或器官，重建解剖和生理功能。
组织工程学包括发挥主要功能作用的种子细胞、可供细胞进行生命活动的支架材料和调节细胞增殖和分化的生物活性分子三个方面。其中支架材料和种子细胞是组织工程目前研究的重要内容，而支架材料作为组织工程研究的人工细胞外基质（extracellular matrix ,ECM），为细胞的停泊、生长、繁殖、新陈代谢、新组织的形成提供支持。
组织工程心脏瓣膜可容纳天然组织材料，包括细胞、细胞外基质和其他生物分子和聚合物等，与血液接触表面的内皮化程度高于机械或生物假体瓣膜。
尽管近年来天然和合成聚合物基支架等几种组织工程支架得到了广泛的应用和快速的发展，但由于难以克服免疫原性、模拟体内微环境以及具有类似于天然器官/组织的机械或生化特性，它们的修复能力有限。脱细胞细胞外基质(dECM)支架的出现为克服这些障碍提供了一种有吸引力的方法，它模拟了具有天然三维结构和各种生物活性成分的最佳非免疫环境。基于dECM支架的细胞种子构建，尤其是干细胞再细胞化构建，被认为是功能器官/组织再生的理想选择。
细胞结合配体如环状精氨酸甘氨酸(cRGD)肽，可促进循环EPCs与组织工程心脏瓣膜的粘附。在动物模型中植入6个月至1年后，体外组织工程、脱细胞瓣膜不仅显示瓣膜组织细胞化，而且瓣膜表面内皮化。来自周围宿主组织的细胞迁移到瓣膜组织进行细胞化，来自循环血液的内皮细胞粘附在瓣膜表面并形成内皮层，通过这种方式，脱细胞瓣膜被原位转化为组织工程生物瓣膜。
在某些情况下，脱细胞瓣膜在植入前进行体外内皮化。与的生理压力相比，在生物反应器中应用逐步增加的压力可以带来更好的内皮化和扩散。在脱细胞瓣膜支架上涂覆蛋白质材料和水凝胶可改善EC的粘附和生长。
但是体外内皮化也有一个最大的问题，就是内皮层不能在体内存活，也不能在生理压力下存活。在Lichtenberg等人的一项研究中，脱细胞猪心脏瓣膜尖端两侧的种子内皮细胞在生物反应器中适度脉动动态环境下实现了融合，当内皮化瓣膜处于完全生理压力下时，再生的内皮细胞被破坏。在脱细胞过程中，α-gal蛋白很难从异种心脏瓣膜中完全去除。这种蛋白质引起免疫反应并阻止细胞化。然而，很少有研究报道在它们发育的脱细胞瓣膜中不存在α-gal蛋白。在Sierad等人进行的一项研究中，对脱细胞猪瓣膜进行静态内皮化，然后在全生理压力下在生物反应器中进行17天的调节。结果表明，由于缺乏a-gal蛋白，调节后细胞扩散得到改善。
除了脱细胞瓣膜组织外，一项研究显示聚合物瓣膜支架在体内植入前进行体外内皮化，采用聚4-羟基丁酸(P4HB)包被聚乙二醇酸(PGA)非织造网制成心脏瓣膜状复合支架，在流量和压力逐渐增加的动态环境中培养14d，然后植入羔羊体内20周。心脏瓣膜支架表面光滑，组织工程瓣膜内无血栓、狭窄或动脉瘤。
与机械瓣膜和生物瓣膜不同，组织工程瓣膜是由活组织材料制成的—细胞外基质成分、细胞和各种生物分子。因此，组织工程瓣膜在植入后具有原位内皮化的潜力。
血管支架
支架通常由不同的金属制成，包括316L不锈钢(316L SS)、镍钛诺和钴铬合金。由于其固有的金属表面特性，血栓会在表现形成导致裸金属支架失效。
金属表面限制了药物负载，直接吸附药物有很大弊端。离子结合技术也不能为药物与金属表面的稳定结合提供解决方案。因此，用各种生物相容性聚合物涂层支架是药物涂层支架(DES）发展的重要手段。
但某些患者可能对聚合物涂层过敏。与不可生物降解的聚合物相反，生物降解聚合物能够暂时停留在支架表面，在聚合物完全侵蚀后，血管壁的炎症较少或没有炎症。所以生物可吸收支架可以解决炎症问题和支架后期血栓形成的问题，然而，它们在装置外形、径向强度和柔韧性等方面的力学性能较差，限制了它们在冠状动脉介入治疗中的应用。
为了促进支架早期内皮化，已经开展了许多研究。改善细胞和物质间的相互作用来增强细胞粘附和生长有助于实现早期内皮化。各种类型的生物分子如硫酸软骨素、肝素、岩藻聚糖和细胞外基质成分-纤维连接蛋白、层粘连蛋白被用于支架表面，以抑制血液凝固和再内皮化。在生理血流条件下，透明质酸涂层支架在狒狒血栓模型中显示血栓形成减少，添加生长因子如VEGF也有利于支架的内皮化。而与抗体涂层支架相比，明胶涂层支架在促进内皮化和减少再狭窄方面的效果要差得多。
表面化学是植入物表面涂覆生物分子的技术之一。在前面章节提到的各种生物分子附着方法中(物理吸附、包封、共价和离子固定化等)，通过希夫基化学或碳二亚胺化学的共价固定化这两种方案的结合稳定性最好。固定化的生物分子能够抵抗纤维蛋白原吸附和血小板粘附，抑制SMCs的增殖，促进EC的粘附、迁移和增殖以及NO的释放，从而导致支架的再内皮化和血液相容性的改善。然而，单生物分子固定不足以获得完整的内皮化溶液;因此，使用几种类型生物分子的混合物进行多生物分子固定化对于最终产生有效的再内皮化必不可少。在带电支架植入物上将几个带电生物分子或其混合物逐层涂覆，是一种简单的药物固定技术。该技术降低了血小板粘附，选择性地调节了血管生长，改善了支架植入部位ECs和EPCs的粘附和增殖。
前面章节提到的微表面图案修饰也是相同的。不同形态的基质，如不同尺寸的平行槽和垂直柱，在粘附、迁移和增殖方面表现出差异性。与柱状图案衬底相比，凹槽图案衬底的内皮化效果更好。这些具有生物分子/药物的表面形态也显示出细胞外基质沉积增强，从而抑制SMC增殖。
NO能够血管舒张、抗动脉粥样硬化、抑制血小板聚集和SMC增殖，在维持血管稳态中起关键作用。支架植入后由于内皮细胞损伤，从损伤部位释放少量NO，导致包括SMCs在内的几种类型的细胞增殖，使血栓形成和再狭窄。因此，通过人工方法释放更多的一氧化氮可以防止在细胞中出现不必要的细胞现象。有几种办法可以让支架稳定释放NO，一种是硒催化剂，硒催化剂可以从亚硝基硫醇化合物中释放NO，将硒催化剂固定在植入物表面，在生理水平上释放NO，可以为支架植入后的再内皮化带来积极的环境。和儿茶酚胺协同的表面化学可以可以提供强粘附涂层，能够长期稳定地释放NO等。
血液中循环EPCs的浓度可能较低，通过静脉或冠状动脉内途径输注体外增殖的EPCs是一个不错的选择。动物模型中的细胞治疗显示加速再内皮化和抑制新内膜形成，在祖细胞输注前对其进行基因修饰可以提高阳性结果。然而，输注后EPCs向ECs的分化仍有争议，在临床应用中，输注EPCs可能会增加炎症信号和SMC增殖，导致再狭窄和血栓形成。另外，除了输注内皮祖细胞，研究表明使用他汀类药物能够抑制平滑肌细胞的增殖，预防新生内膜增生，减轻炎症活动，抑制血栓形成，增加血液中EPC数量，促进EPCs功能。
血管移植物
合成不可生物降解血管移植物
体外内皮化的小直径合成血管移植物仅在非常有限的时间内通畅。在循环血流作用下，移植物表面的内皮细胞脱落，随后血小板粘附和聚集到移植物上，形成血栓。目前用于大直径假体移植物的不可生物降解聚合物包括PET、PTFE和PU，需要进行化学处理后进行使用。
组织工程血管移植物
与组织工程瓣膜一样，组织工程移植物以生物移植物和可生物降解支架为启动结构，由存在于原生组织中的细胞、细胞外基质和其他生物分子组成，内皮细胞可以很容易地粘附、迁移和增殖，从而实现内皮化。利用聚己内酯(PCL)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚锂乳酸(PLLA)、聚乳酸-共乙醇酸(PLGA)等多种合成生物降解聚合物，壳聚糖、胶原蛋白、弹性蛋白、明胶、丝、纤维素等多种天然生物降解聚合物，以及脱细胞组织等多种生物材料，制备人工血管支架和脱细胞血管移植物。然后再使用表面修饰技术利用聚合物、生物分子和生物活性物质来排斥蛋白质和血小板粘附到表面。
基因工程转染的内皮细胞可以通过细胞在移植物/支架表面的粘附、迁移、增殖和分化快速生成内皮层，增强移植物的内皮化。尽管使用了各种细胞友好型生物材料来覆盖移植物表面，以促进EC的粘附和增殖，但临床结果并不乐观。
其他心血管装置的内皮化
对VADs、全人工心脏（Total Artificial Heart，TAH）、起搏器、起搏器导联、神经导联、除颤器导联等其他心血管装置的血液接触面进行了许多表面改性研究，使其植入后具有更好的血液相容性，抑制血液凝固。
心血管装置接触血液表面的微结构可以改善内皮细胞或其祖细胞从血液中的黏附和迁移，如vad的表面，有研究进行表面改性，使表面具有由交替脊状和凹槽组成的特殊工程光栅的微结构形态，从而可能实现ec的迁移和粘附。蜂窝状的弹性体膜表面改善了ECs的保留。除了表面形态外，还可以看到特定材料吸引ec，钛基表面增强了ECs的迁移和粘附。
将主要由胶原原纤维组成的自体组织碎片附着在TAH的血接触表面，并在其上涂上肝素涂层。然后将该装置作为人工器官植入体内。由于肝素释放缓慢，能够避免形成血栓，促进TAH表面内屁话。一项试验中，用戊二醛固定牛心包组织膜覆盖TAHs的左心室和右心室，并植入3名即将死亡的患者。患者均给予抗凝、抗血小板药物治疗。在最长存活254天之后，对外植TAHs进行分析。膜上没有血栓沉积的迹象。然而，在整个膜上可以看到被吸附的纤维蛋白，来自循环血液的内皮祖细胞粘附在膜上。
无铅起搏器体积小，有利于组织内包埋和内皮化。当起搏器导联或除颤器导联被包裹在纤维包中时，表面层被内皮化。内皮化的程度取决于纤维包的设计和材料
血流通过VAD和TAH，内皮化对于这些器械也是一个关键问题，应该努力解决。与主流心血管装置一样，这些装置因其更好的内皮化而有各种研究进行，但促内皮化的临床尚未取得成功。其他心血管装置如起搏器和导联，血栓风险较小，这类设备在外表面内皮化方面的研究较少，只有少部分体外化取得成功。
总结
各类器械的内化进展大致如上，目前对于各类心血管器械的促内皮化技术都有一定进展，比如生物可吸收支架，组织工程支架，各种表面处理技术，但实际的临床应用并不多，期待后续更多的技术实现。这里的文章省略了很多具体的技术细节和文献，仅举例了一些，可以加强一下大家对于这部分技术和材料的初步了解，对于器械有一个不一样的认知。
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