【转移性肾癌综合治疗】PD-L1表达水平在预测转移性肾细胞癌患者预后中的价值

作者：李思明¹  段荣¹  唐碧霞¹  毛丽丽¹  连斌¹  王轩¹  鄢谢桥¹  白雪¹  周莉¹  李彩莉¹  许华艳¹  齐忠慧¹  刘毅强²  迟志宏¹  斯璐¹  崔传亮¹  代杰¹  孔燕¹  郭军¹  盛锡楠¹

作者单位：

¹北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所肾癌黑色素瘤内科 恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室

²北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所病理科  恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室

引用本刊：

李思明，段荣，唐碧霞，等. PD-L1表达水平在预测转移性肾细胞癌患者预后中的价值[J].中华泌尿外科杂志，2020，41（6）：446-453. DOI：10.3760/cma.j.cn112330-20200428-00334.

摘要

目的  

探讨程序性死亡配体1（PD-L1）表达水平对转移性肾细胞癌患者预后的预测价值。

方法  

回顾性分析北京肿瘤医院2014年1月至2016年4月收治的61例转移性肾细胞癌患者的临床病理资料和生存资料。男46例，女15例。中位年龄56（29～75）岁，其中≤60岁41例，＞60岁20例。患者行系统治疗前，单个器官转移36例（59.0%），≥2个器官转移25例（41.0%）；肺转移17例（27.9%），肝转移54例（88.5%）。乳酸脱氢酶（LDH）正常52例，异常4例。MSKCC危险分层（共57例）低危组34例（59.6%），中危组23例（40.4%）。6例（9.8%）初诊时即存在远处转移，其中4例接受原发灶减瘤术；余55例接受根治性肾切除术。采用免疫组化染色方法检测患者肿瘤组织的PD-L1表达水平，将肿瘤细胞膜检测到PD-L1染色≥1%定义为PD-L1阳性表达。分析PD-L1表达水平与临床病理特点的相关性，采用Kaplan-Meier法和log-rank检验比较不同临床病理特点亚组的无病生存时间（DFS）和总生存时间（OS）的差异。采用Cox比例风险回归模型进行生存数据的多因素分析。

结果  

本组61例术后病理诊断为透明细胞癌53例、乳头状肾细胞癌3例、集合管癌1例、易位相关性肾细胞癌2例、未分类2例。WHO/ISUP核分级（共52例）为1～4级分别为4例、20例、19例、9例。T₁期、T₂期、T₃期、T₄期（共60例）分别为26例、12例、20例、2例。淋巴结阳性5例，阴性56例。TNM分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分别为20例、11例、21例、8例。61例的PD-L1阳性表达率为24.6%（15/61）。WHO/ISUP核分级1～4级的PD-L1阳性表达率分别为0、5.0%（1/20）、31.6%（6/19）、44.4%（4/9），差异有统计学意义（P=0.029）；随WHO/ISUP核分级的增加，PD-L1阳性表达率升高，两者间存在线性相关（P=0.006）。基线LDH水平正常组和异常组的PD-L1阳性表达率分别为19.2%（10/52）和75.0%（3/4），差异有统计学意义（P=0.035）。DFS的单因素分析结果显示，PD-L1（P=0.045）、年龄（P=0.014）、WHO/ISUP核分级（P＜0.001）、T分期（P=0.015）、N分期（P=0.026）、TNM分期（P=0.005）与DFS相关；多因素分析结果显示仅WHO/ISUP核分级为DFS的独立预后因素（HR=1.8，95%CI 1.1～2.9，P=0.018）。单因素（P=0.154）和多因素（P=0.902）分析结果均显示，PD-L1不是转移性肾细胞癌患者OS的预后因素。OS的独立预后因素包括：WHO/ISUP核分级（HR=3.0，95%CI 1.1～8.0，P=0.033）和MSKCC危险分层（HR=5.9，95%CI 1.2～29.7，P=0.03）。 

结论  

转移性肾细胞癌患者WHO/ISUP核分级越高，PD-L1阳性表达率越高。PD-L1阳性表达并不是转移性肾细胞癌患者DFS和OS的独立预后因素。

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肾细胞癌是泌尿系统的常见肿瘤之一，约占所有肾肿瘤的90%。约1/3的肾细胞癌患者在初诊时即发现转移，即使在局限期患者中，仍有约30%的患者会在术后随访中发现转移^[1]。肾细胞癌是一种免疫源性肿瘤，研究结果表明肾细胞癌具有潜在的降低宿主抗肿瘤免疫的能力^[2]。以提高机体抗肿瘤免疫为目的的大剂量白介素2治疗使小部分（约7%）转移性肾细胞癌（metastatic renal cell carcinoma，mRCC）患者获得了长期临床完全缓解^[3-4]，但伴随的显著毒性却限制了其临床应用。随着近年来对于免疫逃逸机制的深入研究和理解，新型免疫治疗药物开始用于mRCC治疗，而T细胞在其中扮演了关键角色。

细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA4）和细胞程序性死亡受体1（programmed death 1，PD-1）是T细胞表面的两种受体，可传递抑制性信号，在肿瘤细胞免疫逃逸机制中发挥重要作用^[5-8]。针对这两种受体的抑制剂CTLA4单抗和PD-1单抗在肾细胞癌中得到了临床研究和应用^[9]。CheckMate 025研究明确了纳武利尤单抗（PD-1单抗）可以作为晚期肾细胞癌的二线治疗^[10]。CheckMate 214研究结果显示，纳武利尤单抗+Ipilimumab（CTLA4单抗）双免疫治疗可以作为中高危晚期肾细胞癌患者的一线治疗^[11]。

PD-L1是PD-1受体的配体之一，表达于免疫细胞和肿瘤细胞表面，是一种跨膜蛋白，由CD274基因编码^[12]。PD-L1表达对于临床病理和预后的指导意义在各大瘤种中得到了广泛研究并被发现可能与患者预后相关，但其作为mRCC的预后标志物目前还存有争议^[13-15]。我们回顾性分析北京肿瘤医院2014年1月至2016年4月收治的61例mRCC患者的病例资料，探讨PD-L1表达水平在预测mRCC患者预后中的意义。

对象与方法

一、一般资料

本组61例，男46例，女15例。中位年龄56（29～75）岁，其中≤60岁41例，＞60岁20例。患者行系统治疗前，单个器官转移36例（59.0%），≥2个器官转移25例（41.0%）；肺转移17例（27.9%），肝转移54例（88.5%）。乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）正常52例，异常4例。根据MSKCC危险分层(共56例)^[16]，低危组34例（59.6%），中危组23例（40.4%）。6例（9.8%）初诊时即存在远处转移，其中4例接受原发灶减瘤术；余55例接受根治性肾切除术。共59例（96.7%）接受了肾脏原发灶手术，2例（3.3%）未接受原发灶手术。

初诊疾病分期按照2010年AJCC第7版TNM分期进行。无病生存时间（disease-free survival，DFS）定义为从患者接受原发灶手术到疾病复发的时间间隔；总生存时间（overall survival，OS）定义为从患者病理初诊肾癌到死亡的时间间隔。

二、PD-L1免疫组化染色检测及结果判定

所有患者肿瘤标本采用4%甲醛固定液，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片。采用 Elivison二步法检测，鼠抗人PD-L1单克隆抗体22C3（稀释度为1∶50），二抗为即用型，购自中杉金桥公司。实验步骤按照各试剂说明书进行。阳性对照采用已知的阳性切片，PBS代替一抗作为阴性对照。在高倍镜下（×400）随机观察3个不连续视野，计算阳性细胞占肿瘤细胞总数百分比，≥1%定义为PD-L1阳性表达，＜1%定义为阴性表达（图1）。

三、统计学方法

采用SPSS 26.0统计软件处理数据。计数资料采用例数（%）表示，采用χ²检验或者Fisher精确检验分析PD-L1表达与患者临床病理特点之间的相关性，对于有序分类变量（如WHO/ISUP核分级等）与PD-L1表达之间的相关性分析采用线性相关χ²检验。Kaplan-Meier法和log-rank检验用于比较不同临床病理特点下的DFS和OS差异。Cox比例风险回归模型用于进行生存数据的多因素分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

一、临床病理特点及治疗情况

所有患者经手术或活检病理证实为肾细胞癌，包括透明细胞癌53例、乳头状肾细胞癌3例、集合管癌1例、易位相关性肾细胞癌2例、未分类2例。WHO/ISUP核分级(共52例)为1～4级分别为4例、20例、19例、9例。T₁期、T₂期、T₃期、T₄期(共60例)分别为26例、12例、20例和2例。淋巴结阳性5例，阴性56例。TNM分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分别为20例、11例、21例和8例。所有患者一线均接受了针对血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）的酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）治疗，其中采用舒尼替尼41例，索拉非尼14例，阿昔替尼3例，培唑帕尼1例，安罗替尼1例；1例集合管癌患者一线接受吉西他滨及顺铂化疗联合索拉非尼靶向治疗。

二、PD-L1表达及其与临床病理因素的相关性

本研究61例中，15例PD-L1表达阳性，阳性率为24.6%。PD-L1阳性表达率与临床病理特征的关系见表1。基线LDH水平正常组的PD-L1阳性表达率显著低于异常组（P=0.035）。54例（88.5%）送检样本取自肾原发肿瘤，PD-L1阳性表达率为22.2%（12/54）；7例（11.5%）样本来自转移灶，PD-L1阳性表达率为42.9%（3/7），两组间差异无统计学意义（P=0.468）。WHO/ISUP核分级1～4级的PD-L1阳性表达率差异有统计学意义（P=0.029）。线性相关χ²检验结果显示，随着WHO/ISUP核分级的增加，PD-L1阳性表达率逐渐升高（P=0.006）。

三、生存分析

本研究61例中位随访时间为84.0个月（95%CI 16.0～233.0）。55例根治性肾切除术后患者可分析DFS，所有患者可分析OS。中位DFS为14.0个月（95%CI 7.6～20.4）。PD-L1阳性组和阴性组中位DFS分别为3.0个月（95%CI 0.0～8.9）和17.0个月（95%CI 6.4～27.6），差异有统计学意义（P=0.045，图2）。年龄≤60岁组和＞60岁组中位DFS分别为8.0个月和33.0个月，差异有统计学意义（P=0.014）。WHO/ISUP核分级1～4级的中位DFS分别为64.0、31.0、13.0、2.0个月，总体比较差异有统计学意义（P＜0.001）。T_1～4期的中位DFS分别为17.0、16.0、6.0、2.0个月，总体比较差异有统计学意义（P=0.015）。淋巴结阴性组和阳性组中位DFS分别为16.0个月和2.0个月,差异有统计学意义（P=0.026）。DFS的单因素分析和多因素分析结果见表2和表3，结果显示PD-L1表达水平不是DFS的独立预后因素，WHO/ISUP核分级是DFS的独立预后因素（HR=1.8，95%CI 1.1～2.9，P=0.018）。

本研究61例的中位OS为126.0个月（95%CI 89.8～162.2）。PD-L1阳性组和阴性组的中位OS分别为63.0个月（95%CI 22.8～98.2）和126.0个月（95%CI 84.1～167.9），差异无统计学意义（P=0.154，图2）。T_1～4期中位OS分别为126.0、152.0、122.0、14.0个月（P=0.022），淋巴结阴性组和阳性组中位OS分别为126.0和44.0个月（P=0.030），差异均有统计学意义。OS的单因素分析和多因素分析结果见表2和表3， WHO/ISUP核分级（HR=3.0，95%CI 1.1～8.0，P=0.033）和MSKCC危险分层（HR=5.9，95%CI 1.2～29.7，P=0.030）是0S的独立预后因素，而PD-L1表达水平不是OS的独立预后因素。

讨论

自从1999年Dong等^[12]发现PD-L1是T细胞共刺激分子B7家族的成员，表达于巨噬细胞系细胞，是位于细胞表面的一个跨膜糖蛋白之后，PD-L1表达在各大瘤种的研究中受到了广泛关注。PD-L1通过与PD-1受体的结合来传递抑制性信号，抑制肿瘤特异性T细胞介导的细胞免疫，包括诱导T细胞凋亡、抑制细胞因子产生以及降低活化T细胞的细胞毒性作用等，从而帮助肿瘤细胞逃避抗肿瘤免疫^[6-7]。

在明确PD-1/PD-L1轴发挥抑制性调节功能的基础上，PD-L1的表达往往被认为与肿瘤预后不良相关，甚至可能是临床抗肿瘤治疗的不利预测因素。实际上，在乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结直肠癌等的研究中的确发现了PD-L1与预后之间存在负相关^[17-19]。但也存在不同的观点，如一项乳腺癌的研究结果表明，PD-L1的表达上调发生于20%的患者中，并且与大肿瘤、高分级、雌激素受体/孕激素受体阴性、人表皮生长因子受体2阳性以及高细胞增殖率等不利因素相关，但却与患者生存预后无关^[20]。

类似的现象同样发生于肾细胞癌的研究中。Thompson等^[21]首次用免疫组化方法研究了肾细胞癌中的B7-H1（PD-L1）表达，发现其阳性表达率为24%，与分期晚、大肿瘤、高Fuhrman核分级、肿瘤坏死等不利病理因素有关；PD-L1表达还与肾细胞癌患者发生远处转移以及死亡相关。而Abbas等^[14]的研究结果表明，PD-L1的表达（阳性率为20.9%）与淋巴结转移、远处转移以及更高的肿瘤分期有关，但多因素分析结果提示其与总生存无明显相关性。一项Meta分析结果显示，与PD-L1低表达患者相比，高表达患者的死亡风险翻倍（HR=2.05，95%CI 1.38～3.05，P＜0.001），但同时，这种相关性在Meta分析纳入的各项研究之间存在着显著的异质性，因此认为PD-L1表达与预后的相关性还需要谨慎解释和对待^[22]。

在本研究中，我们发现PD-L1在mRCC中的阳性表达率为24.6%，并与WHO/ISUP核分级相关，WHO/ISUP核分级越高，PD-L1表达率越高，提示PD-L1与mRCC恶性程度和侵袭性相关。以上结果与既往研究结果高度一致。我们在生存相关单因素分析中发现，PD-L1阳性表达者DFS明显更短，同样能够预测DFS的还有肿瘤分期和WHO/ISUP核分级等。但多因素分析结果显示，仅WHO/ISUP核分级是预测DFS的危险因素。我们认为原因可能是PD-L1表达与WHO/ISUP核分级存在线性相关，而WHO/ISUP核分级又是DFS的独立预后因素。因此，在剔除了性别、年龄、病理类型、分期、分级等混杂因素后，多因素分析结果显示单纯的PD-L1表达并不能预测DFS。同样，在OS分析中无论是单因素还是多因素分析，结果均显示PD-L1表达与OS之间并无明确相关性。而与OS独立相关的仍然是WHO/ISUP核分级、MSKCC危险分层等预后因素。

其实，PD-L1不仅是在对mRCC的预后意义上存有争议，对于mRCC免疫治疗的预测意义同样并不明确。CheckMate 214研究中^[11]，PD-L1阳性（≥1%）的中高危mRCC患者接受纳武利尤单抗+Ipilimumab双免疫治疗后的客观缓解率（overall response rate，ORR）、无进展生存时间（progression-free survival，PFS）和12个月生存率分别为58%、22.8个月和86%，而在PD-L1阴性中高危患者中，相应的数据分别为37%、11.0个月和80%；阳性患者的免疫治疗疗效优于阴性患者。但在CheckMate 025研究中^[10]，接受纳武利尤单抗免疫治疗后PD-L1≥1%的mRCC患者OS为21.8个月，而PD-L1＜1%患者的OS为27.4个月，阴性患者（PD-L1＜1%）OS更具优势。JAVELIN Renal 101研究^[23]比较了Avelumab+阿昔替尼的免疫靶向联合治疗与舒尼替尼单药治疗mRCC的结果，在PD-L1阳性（≥1%）患者和不区分PD-L1表达状态的总患者人群中，免疫靶向联合组的中位PFS都是13.8个月。另一项Keynote 426研究（帕博丽珠单抗+阿昔替尼与舒尼替尼）^[24]结果则显示免疫靶向联合组中，PD-L1阳性（≥1%）和阴性（＜1%）mRCC患者的12个月生存率（90.1%与91.5%）和中位PFS（15.3个月与15.0个月）无明显差异。鉴于此，各大肾癌指南目前并没有将PD-L1作为免疫治疗或者免疫靶向治疗前的预测标志物进行推荐。

造成各研究中PD-L1表达对mRCC预后的预测意义不尽相同的原因可能是多方面的。首先，目前对于PD-L1免疫组化检测缺乏统一的标准，不同的诊断公司设计不同的PD-L1检测抗体，检测对象也区分为肿瘤细胞或免疫细胞，判断阳性的界值也各不相同（1%、5%、10%、50%），这些都给研究结果的横向对比带来了困难。其次，诸如PD-L1在肿瘤内和肿瘤间的异质性、组织缺氧水平对于PD-L1表达的影响等因素都有可能给PD-L1的免疫组化检测结果带来影响。本研究中原发灶和转移灶的PD-L1阳性表达率分别为22.2%和42.9%，虽有差异，但无统计学意义。由于本研究仅7例样本来自转移灶，其他54例均来自原发灶，且非配对样本，因此无法对原发灶和转移灶的PD-L1表达一致性得出肯定的结论，需要更大样本的配对研究来帮助我们进一步认识这个问题。第三，抗肿瘤治疗等临床因素对生存带来的改变可能影响对PD-L1预测预后意义的判断。这也是今后的研究需要考虑的问题。此外，本研究为样本量相对偏小的回顾性研究，还需要进一步扩大样本量对结果做出更好的解释。

正是由于上述对于PD-L1在mRCC中的预后价值存在争议，目前的研究已经转向其他免疫标志物，包括肿瘤突变负荷^[25]、肿瘤浸润性淋巴细胞^[26]、PD-L2以及联合免疫标志物等^[27]；甚至开始探索新型免疫标志物，包括针对PD-1/CTLA-4之外的其他免疫检查点，例如IDO、LAG-3等^[28]，已经用于肾细胞癌的预后研究中。

综上所述，本研究结果显示mRCC患者WHO/ISUP核分级越高，PD-L1阳性表达率越高。单因素分析结果显示PD-L1阳性表达者DFS时间更短，但多因素分析结果显示PD-L1阳性表达并不是DFS和OS的独立预后因素。PD-L1表达对mRCC患者预后判断的意义还需进一步研究。

参考文献（略）