1594年(万历22年),朝廷命兵部侍郎邢玠总督川、黔进剿应龙。邢玠到重庆调查土司之间关系,查得永宁(今四川泸州以南)、酉阳(今四川东南彭水、秀山、酉阳)二土司和应龙要好,结有婚姻关系。而贵州的黄坪(今黔东南黄平县)、白泥(今余庆县)二土司和应龙有久怨深仇。于是,邢玠明喻应龙,不定应龙死罪。此时,水西宣慰使安疆臣进京请求其父享有抚恤的资格,兵部尚书石星亲自写信给安疆臣叫他带给应龙,说应龙会因此而被赦免罪过。安疆臣到播州会见杨应龙。当时,播州辖地内五司七姓担心应龙被赦免罪过后对其不利,便从中作梗,阻止驿站朝廷文书传送,邢玠命重庆知府王士琦到綦江调查杨应龙的罪过,王士琦到綦江便派綦江知县溥林前往安稳(今綦江至松坎间)劝说应龙。应龙敬佩溥林,溥林单人匹马前往。于是,应龙放下兵器迎接溥林。溥林劝说应龙,陈述总督邢玠之意,应龙俯首听命。
此后,应龙命其弟兆龙到安稳,在路边极其诚恳地跪着迎接王士琦。并告诉王士琦,此次娄山战事应龙不知,全是手下人干的,应龙已绑缚了娄山战事的罪魁在松坎等待王士琦前去定罪。应龙之所以不敢来安稳,是怕安稳仇人报复,并请求王士琦前往松坎商议。王士琦听后说:“在松坎调查应龙罪过,如在囊中取物,非常安全。”于是,单人匹马前往松坎。
王士琦到松坎后,应龙绑缚自己,跪在路边,哭着向王士琦请求定自己死罪,并愿交出娄山战事的罪魁和献纳罚金。王士琦随后请示邢玠,邢玠同意了应龙的请求。于是杨应龙用计捆绑阿羔、黄元等十二人抵罪,愿交四万两罚金帮助采伐木材。应龙被革除所有官衔让其长子朝栋代理,次子可栋羁留重庆府作人质,黄元等被斩于重庆。
当时,东南沿海倭寇未扫除,明朝兵部准备缓解与应龙的矛盾,使其尽力平倭。朝廷也念应龙多有功劳,因而准许了奏章,应龙免罪获释,只是可栋仍作人质拘于重庆狱中,以追缴赎金。
随后,作为人质的可栋死于重庆。消息传至播州,杨应龙新仇旧恨一并齐发,急忙到重庆府索要儿子尸体,未得准许,于是应龙更加仇恨。此时,朝廷追缴赎金的文书又至,杨应龙非常愤恨地说道:“我儿子活转来,银子就送来了。”就这样,应龙召集一千多僧人前往重庆招回儿子魂魄。
杨应龙不缴赎金,料官军必来征剿,便积极备战。一面固关隘,分派土目(土司官员)设置关隘,占据险要之地;一面整饬内部,清除异己,对已去黔省告状的五司七姓所拥有的大量财富及庄园予以没收,并分配给民众,用金钱和财物厚待苗族,使其甘心帮助自己。还组织了十五万人的“涅手军”。
公元1596年(万历24年),应龙出兵侵占草塘(今正安县)、余庆二司,焚其司衙,并趁此扫平了都匀、兴隆(今黄平)各卫。围剿屠杀黄平,戮重安长官司全家。
公元1597年(万历25年),应龙借朝廷东征倭寇之际,统领苗兵,趁机四面出击。向北占领江津、南川,逼近合江。随即又侵占贵州的高坪、洪头、新村。向东侵占湖南四十八屯,阻塞驿站文书传递。应龙仇人宋世臣、罗承恩挈带全家,逃往偏桥(今施秉县)避难,应龙攻入偏桥城,奸淫其妻女,杀其全家。
公元1599年(万历27年),贵州巡抚江东之命都司杨国柱、指挥李廷栋率三千兵(亦说二万)进剿应龙。应龙放弃三百部落,佯装失败,诱敌深入。于古历2月设伏兵于飞练堡,聚而歼之。杨国柱、李廷栋战死,其余官兵也无一生还。
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