1594年（万历22年），朝廷命兵部侍郎邢玠总督川、黔进剿应龙。邢玠到重庆调查土司之间关系，查得永宁（今四川泸州以南）、酉阳（今四川东南彭水、秀山、酉阳）二土司和应龙要好，结有婚姻关系。而贵州的黄坪（今黔东南黄平县）、白泥（今余庆县）二土司和应龙有久怨深仇。于是，邢玠明喻应龙，不定应龙死罪。此时，水西宣慰使安疆臣进京请求其父享有抚恤的资格，兵部尚书石星亲自写信给安疆臣叫他带给应龙，说应龙会因此而被赦免罪过。安疆臣到播州会见杨应龙。当时，播州辖地内五司七姓担心应龙被赦免罪过后对其不利，便从中作梗，阻止驿站朝廷文书传送，邢玠命重庆知府王士琦到綦江调查杨应龙的罪过，王士琦到綦江便派綦江知县溥林前往安稳（今綦江至松坎间）劝说应龙。应龙敬佩溥林，溥林单人匹马前往。于是，应龙放下兵器迎接溥林。溥林劝说应龙，陈述总督邢玠之意，应龙俯首听命。
此后，应龙命其弟兆龙到安稳，在路边极其诚恳地跪着迎接王士琦。并告诉王士琦，此次娄山战事应龙不知，全是手下人干的，应龙已绑缚了娄山战事的罪魁在松坎等待王士琦前去定罪。应龙之所以不敢来安稳，是怕安稳仇人报复，并请求王士琦前往松坎商议。王士琦听后说：“在松坎调查应龙罪过，如在囊中取物，非常安全。”于是，单人匹马前往松坎。
王士琦到松坎后，应龙绑缚自己，跪在路边，哭着向王士琦请求定自己死罪，并愿交出娄山战事的罪魁和献纳罚金。王士琦随后请示邢玠，邢玠同意了应龙的请求。于是杨应龙用计捆绑阿羔、黄元等十二人抵罪，愿交四万两罚金帮助采伐木材。应龙被革除所有官衔让其长子朝栋代理，次子可栋羁留重庆府作人质，黄元等被斩于重庆。
当时，东南沿海倭寇未扫除，明朝兵部准备缓解与应龙的矛盾，使其尽力平倭。朝廷也念应龙多有功劳，因而准许了奏章，应龙免罪获释，只是可栋仍作人质拘于重庆狱中，以追缴赎金。
随后，作为人质的可栋死于重庆。消息传至播州，杨应龙新仇旧恨一并齐发，急忙到重庆府索要儿子尸体，未得准许，于是应龙更加仇恨。此时，朝廷追缴赎金的文书又至，杨应龙非常愤恨地说道：“我儿子活转来，银子就送来了。”就这样，应龙召集一千多僧人前往重庆招回儿子魂魄。
杨应龙不缴赎金，料官军必来征剿，便积极备战。一面固关隘，分派土目（土司官员）设置关隘，占据险要之地；一面整饬内部，清除异己，对已去黔省告状的五司七姓所拥有的大量财富及庄园予以没收，并分配给民众，用金钱和财物厚待苗族，使其甘心帮助自己。还组织了十五万人的“涅手军”。
公元1596年（万历24年），应龙出兵侵占草塘（今正安县）、余庆二司，焚其司衙，并趁此扫平了都匀、兴隆（今黄平）各卫。围剿屠杀黄平，戮重安长官司全家。
公元1597年（万历25年），应龙借朝廷东征倭寇之际，统领苗兵，趁机四面出击。向北占领江津、南川，逼近合江。随即又侵占贵州的高坪、洪头、新村。向东侵占湖南四十八屯，阻塞驿站文书传递。应龙仇人宋世臣、罗承恩挈带全家，逃往偏桥（今施秉县）避难，应龙攻入偏桥城，奸淫其妻女，杀其全家。
公元1599年（万历27年），贵州巡抚江东之命都司杨国柱、指挥李廷栋率三千兵（亦说二万）进剿应龙。应龙放弃三百部落，佯装失败，诱敌深入。于古历2月设伏兵于飞练堡，聚而歼之。杨国柱、李廷栋战死，其余官兵也无一生还。
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