上期(驾驭基因表达调控(2)如何提高兴趣基因的表达水平?)说到提高宿主特定基因拷贝数的方法有直接和间接两种。
直接方法很好理解,通过载体外源转入目的基因编码序列和必须的基因表达调控元件(启动子等)就能实现。
然而生物体本身就具有非常丰富的基因表达调控手段,很多都是针对非编码区实现的。既然非编码区可以影响基因表达水平。我们可不可以模拟这个过程间接调控基因表达?
这个设想的实现最基本需要解决两个问题:基因在基因组的定位和激活。
定位问题 2007 年已经在 CRISPR/Cas9 系统中实现。该系统通过 gRNA 介导 Cas9(Cas9 蛋白是一种可以在gRNA介导下进行双联切割的核酸内切酶。)定位到基因组特定位点,达到极其精确的定点编辑效果。
借助基因组中名为前间区序列邻近基序(protospacer adjacent motif ,PAM),的 DNA 碱基序列模式,CRISPR/Cas9 系统几乎可以定位到任意基因组区域。
到 2013 年,基于 dCas9 的 CRISPR interference (CRISPRi) 技术成功实现可逆的基因表达抑制,避免了 CRISPR/Cas9 对核酸序列的切割。
dCas9 是一种失去核酸剪切能力的 Cas9 蛋白变体。将负责 DNA 双链剪切的两个核酸酶活性域 RuvC1和 NHH 突变后,dCas9 可以在保留 gRNA 结合能力的情况下,定向结合到特定基因位点。
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