又是周四啦，我们又见面啦。现在地标北京，我今天到北京来参加儿博会的交流学习。这是第一次觉得北京比重庆热，北京温度34℃，而重庆是27°。感觉还挺奇特的。今年重庆的天气简直好到爆，看了最近天气预报，一直到月底才会升温。在这里先感谢我的小仙女师妹，因为昨天晚上离开实验室比较急，很多素材还没有拍照。所以远程遥控了她帮我拍的照片。这有一半她的功劳。
在过去的一周比较特别，因为我做了有关qRTPCR的实验。为什么特别呢？第一，我的标本是一批子宫内膜原代上皮细胞；第二，这批细胞存放在RNA裂解液，并放置于-20℃冰箱中14个月（图1）；第三，因为细胞珍贵且存放时间长，所以提取出的RNA含量平均只有10-40ng/uL；第四，因为即将毕业，所以把实验安排的比较急，一天做了10个96孔（图2）。
这次的整个实验开始都是在一个十分不利的环境中，我和很多人一样都想过要放弃。但是，但是因为这个细胞十分珍贵，非常难培养，且来之不易（这是我的导师从美国给我带来的）。另外之前我也做过几十ng/uL的RNA标本，所以斗胆一试。
那面对这样浓度的RNA标本，我首先要把RNA浓度给提升上去，那怎么提升呢，今天给大家分享我常用的两个DNA/RNA浓缩方法。
所谓浓缩，就是在总含量一定的基础上，减少液体体积量，这样浓度就会提升上去了。就是基于这么简单的一个道理，Thermo fisher生产了一台可以浓缩DNA/RNA的仪器，如下图3。
一般RNA标本在选择中档，中温，一个小时内，RNA的浓度可以提升2-5倍，并且不会降解。如果时间过长、温度过高都会造成RNA的降解；对于DNA标本的话，可以自行选择。
在使用机器前最好把机器从内到外用75%酒精消毒，小心操作，尽量避免所有可以接触到DNA酶或RNA酶的操作。在这里，肯定有很多人会质疑说高温会不会使RNA/DNA降解，尤其是RNA。不知道大家在使用Takara进行RNA逆转的时候，第一步有个85℃的步骤，不知道有没有注意到呢。
因为这个机器主要装1.5或2mL的EP管，所以在操作时需要把盖子打开，所以如果有可能请将此仪器放入一个相对比较干净的环境。
其他的操作按着说明书来就可以。
另外一种浓缩方法是许多测序公司用来浓缩的办法，我也不晓得具体叫什么名字，所以直接介绍步骤。
配置3M pH=5.2的醋酸钠，0.22um滤器过滤保存，切记，此溶液若想长期保存，请置于玻璃容器中（一般人我不告诉他）不然容易析出，短期使用的话是可以放在塑料容器中的。
配置75%的乙醇，此处用于配置的无水乙醇需要用到分析纯，至于-20°中保存。
准备一定量的无水乙醇至于-20°中保存。
准备异丙醇。
在RNA/DNA标本中加入1/10体积的醋酸钠，混匀。
加入1中2倍体积的100%、-20°保存的无水乙醇，混匀，置于-80°中至少放置20min或-20°中至少放置2h。
加入2/3体积的异丙醇，室温放置1min。
离心，大于11000g，4°，30min。
弃上清，加入75%冰乙醇混匀。
重复步骤4。
控干，加入需要体积的DEPC水。
因为我之前有多次用Thermofisher DNA L200浓缩RNA的经验，并且我只是希望RNA的浓度提升到60-70之间。所以我这一次实验就是用真空浓缩了RNA，中档、半小时，最后测定的浓度大概升高了2-5倍。
我们都知道一个逆转录体系一般逆转1ugRNA，20uL体系。而你得到的cDNA在做qRT-PCR时会稀释10倍再用，每一个qRT-PCR反应用到2uL。意思就是你的RNA量有个5ng/uL就可以做出后面的qRT-PCR。看到这里，是不是很兴奋。我通过这样一算，瞬间觉得我肯定做的出来。
我把RNA统一到30ng/uL。
Takara的体系最多可以加到7uL的量，意思就是我的每个逆转录反应体系用到的总RNA量是210ng。
因为标本珍贵，所以也就没有在乎逆转录酶了，我的RNA总体积是30-40uL，所以我每个标本逆转了4-5个，所以总共是80-100uLcDNA。
根据以上我们可以知道我的这个cDNA还可以对半稀释。
我最后用了上述的cDNA跑了10个板子的荧光定量PCR。给大家看看其中一组的扩增曲线。
最后结果还挺好的。之所以分享这次经历，并不是让大家铤而走险哟，只是告诉大家在标本很珍贵的情况下，多一种可能性，多一种选择。希望大家实验顺利。最后来张北京的天，证明我来了，哈哈哈哈哈哈。好无聊。
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