Nature：为lncRNA正名，首次发现lncRNA突变会导致人类严重遗传病

人类基因组中有关于疾病变异的研究已经取得了巨大的进展。然而，非编码基因组中的变异仍然需要更多的探索。非编码基因的变异可通过多种机制导致疾病，例如破坏顺式调控元件、干扰非编码转录物的功能等。事实上，虽然人类基因组的很大一部分被转录成RNA，但大多数转录本缺乏蛋白质编码潜能，被称为非编码转录物。研究显示，非编码转录物可通过多种机制，调控基因表达。但是，如何鉴定具有功能的非编码转录位点非常具有挑战性。

近日，来自德国马克斯·普朗克分子遗传学研究所的 Stefan Mundlos 团队在 Nature 杂志发表题为：Non-coding deletions identify Maenli lncRNA as a limb-specific En1 regulator 的研究论文。

研究团队通过人和小鼠的实验表明，在人类2号染色体上存在一个lncRNA位点——Maenli，其缺失导致严重的先天性肢体畸形。机制上，Maenli的转录活性顺式作用调控En1基因在肢体特异性的激活，从而微调控制发育肢体芽背腹极性的基因调控网络，其缺失导致En1相关的被腹侧肢体表型。

研究人员首先在3名不相关肢体畸形的病人中发现2号染色体上有27-63kb的非编码区缺失，同时外显子测序并没有发现双等位基因治病突变体。患者出现腿、脚的严重缩短和变形、手的3/4并指、第四和第五的手掌侧有指甲。X射线显示股骨正常，但胫骨、三角腓骨严重缩短，足部骨骼畸形或缺失。

将3名病人所重叠的非编码缺失定义为MCR，MCR位于EN1上游-300kb，而EN1是肢体背腹侧模式形成的关键基因。纯合缺失MCR的小鼠（Del（27））出生符合孟德尔遗传，但是发生肢体畸形，与EN1基因失活的表型类似，即Del（27）小鼠表现出人类的双背肢表型，。原位杂交表明，E11.5天的小鼠胚胎中，MCR缺失导致肢体中特异性缺失EN1，而EN1仍旧在腹侧顶端外胚层嵴（AER）、外胚层、后脑、脊髓和体节中表达。即在患者中发现的缺失是通过特异性改变EN1在四肢的表达而导致疾病的。

下一步，研究人员想要鉴定出MCR中控制肢体中En1表达的调控元件。对MCR区域进行数据库搜索，发现MCR有类似EST CB192634的序列，具有非编码转录本的特征。综合RNA-seq和H3K27ac的信息，发现MCR中存在一个含有4个外显子的非编码转录本，RACE分析发现其含有两种剪切形式。而且E9.5天时（En1开始在肢体中表达），这个转录本在小鼠肢体的细胞中富集，将之命名为Maenli。小鼠的Maenli基因位点包含11kb，肢体中其转录起始位点TSS具有H3K27ac和H3K4me3标记。Maenli在E9.5的肢体中表达，随后表达下降，而En1表达维持不变。利用单细胞测序分析，发现Maenli并非分布于整个肢体，其表达仅限于En1表达的区域。在Maenli TSS删除1.4kb的DNA片段，导致肢体中Maenli和En1的表达减少98%，且成年小鼠出现双背肢表型，与Del（27）小鼠的表型类似。保留Maenli TSS序列的完整性但进行插入三重聚腺苷酸化终止序列（pAS），导致En1表达减少90%，出现双背肢表型；保留Maenli TSS序列的完整性但进行插入反向pAS，则Maenli和En1的表达无影响，小鼠与野生型无差异。说明肢体特异性En1表达不是由Maenli TSS增强子活性驱动的，而是Maenli转录的过程或成熟的Maenli转录本自身导致的。

进一步研究发现，En1的激活不需要Maenli转录本的特殊序列或结构，而Maenli转录本的长度或与En1的激活有关。由姐妹等位基因产生的Maenli转录本不能挽救Maenli在一个等位基因上的失活，且En1在肢体中的激活依赖于Maenli转录本的顺式作用。

最后，研究人员对Maenli的作用机制进行探索，发现Maenli转录本的顺式作用有助于在En1基因位点及其周围的调控区域建立开放性的染色质环境，这将允许En1激活和腹侧外胚层细胞命运决定所需的转录因子、En1表达调控所需的增强子元件等进行结合和调控。

总的来说，该研究发现了人类2号染色体上存在一个lncRNA位点——Maenli，其通过顺式作用调控EN1在肢体特异性的表达，从而调控肢体的发育。同时证明了lncRNA的突变可导致人类孟德尔遗传疾病，为理解疾病的病理发生提供了新的视角。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41586-021-03208-9