进一步了解口蹄疫非结构蛋白抗体......

关于通过监测非结构蛋白抗体来

评价口蹄疫疫苗纯度的研究进展

 

摘要：口蹄疫 （Foot and Mouth Disease，FMD） 是由口蹄疫病毒引起的在偶蹄动物间传播的 A 类烈性传染病。大多数发展中国家一直都通过注射灭活疫苗的办法来控制该病的流行，如何评价和控制口蹄疫疫苗质量成为关键。OIE 建议，通过监测接种至少两次口蹄疫疫苗的动物血清是否产生非结构蛋白抗体，来评价口蹄疫疫苗纯度，从而为兽用生物制品厂家提供一种可供参考的质控方法。总之，使用高效的新型疫苗并结合不同检测方法，给预防和消灭 FMD 带来希望。

 

口蹄疫（Foot and Mouth Disease，FMD）是由口蹄疫病毒引起的在偶蹄动物间传播的烈性传染病，被世界动物卫生组织（OIE）和联合国粮农组织（FAO）列为 A 类动物传染病之首。口蹄疫病原是口蹄疫病毒，属微核糖核酸病毒科（Picornaviridae）口蹄疫病毒属 （Aphthavirus），有 A、O、C、SAT1、 SAT2、SAT3 以及 Asia 1 型 7 个血清型，每个血清型又包含若干个亚型。该病毒不仅在各型间没有交叉免疫性，同血清型的各亚型之间也仅有部分交叉免疫性。该病传播快、宿主范围广、发病率高，对畜牧业发展构成极大威胁。大多数亚洲、非洲、南美洲国家一直都通过注射灭活疫苗的办法来控制该病的流行。因此，使用高质量安全有效的疫苗，是成功预防控制直至最终消灭 FMD 的先决条件。

 

1  口蹄疫灭活疫苗

FMD 疫苗的整个研究和应用情况看，活毒疫苗由于其自身固有的缺陷，已经被世界上许多国家摒弃；新型疫苗虽然取得一些非常有前途的结果，但在免疫效力和经济上目前难与常规疫苗竞争。常规灭活疫苗仍然是当前 FMD 免疫控制采 用的主要疫苗。

FMD 灭活疫苗诱发有效的免疫应答，通常需要较大量的抗原，即疫苗的抗原含量直接决定了疫苗的质量和免疫效果。低抗原含量意味着疫苗效力低和免疫持续期短，高抗原含量意味着疫苗效力高和免疫持续期长。

因此，在灭活疫苗特别是多价苗生产中，为了获得高效的疫苗保证免疫效果，降低疫苗使用剂量，同时降低疫苗中非病毒蛋白引起的变态反应，减少接种引起的有害反应，利于病毒抗原和成品苗的贮存，便于免疫和感染的鉴别，就必须对病毒抗原进行浓缩纯化。

现在常用于大规模生产的纯化浓缩方法是超滤和聚乙二醇 （PEG）或聚乙烯氧化物（PEO）沉淀法和色谱柱过滤法等，不仅可以达到理想的浓缩倍数，还可大大降低抗原收获物中非病毒蛋白成分及含量。用超滤法浓缩 FMDV 制备品的开拓者是 Stro-hmaier。目前，在生产中用切向流超滤装置或中空纤维过滤系统或震动筛进行浓缩。选择质量优良的超滤系统是重要的，必须严格保证超滤系统的无菌，同时定期检查和更换滤芯确保纯化浓缩的效果。使用分子质量为 6000（PEG6M） 的 PEG（聚乙二醇 ） 纯化时，能够充分去除来源于 BHK 疫苗中引起过敏反应的物质。沉淀的抗原用低速离心法获得，也可用助滤剂进行沉淀抗原的过滤，如钙化的硅藻土，比离心法方便的多。灭活抗原也能用 PEO 沉淀法有效的沉淀。PEG 沉淀可充分除去变应原成分，PEO 可使 FMDV 浓缩达 1000倍，从病毒收获物中最少除去 95 %的杂蛋白质。

现代 FMD 灭活疫苗与其他动物卫生方法合用，不但可以根除地方性 FMD，还可以抵抗和清除发生在无 FMD 国家和地区的 FMD，研究表明，疫苗可以迅速的减少接触传染，猪、牛、羊在接种 3d ～ 5d 内可产生有效免疫应答。

FMD 在亚洲、非洲、中东和南美洲的许多国家都有发生。绝大多数欧洲国家及部分南美洲国家或地区通过大量疫苗接种战役，在 20 世纪后半叶完成了对 FMD 的控制，收到了显著成效。疫苗接种被作为有效预防 FMD 的可靠手段，目前仍在广泛应用。例如，在有 FMD 流行的国家每年都要有计划地免疫预防接种；受 FMD 威胁国家除进行严格的进口检疫外，对边境地区亦进行定期的疫苗预防接种；无 FMD流行或已消灭了 FMD 的国家在疫苗库中也储备了一定数量的战备疫苗。构建 FMD 疫苗库的意义主要有两个方面，一是已经消灭 FMD 的发达国家以此生产应急疫苗作为战略储备，应对 FMD 突发事件；二是对有可能传入的 FMDV 新的血清型储备免疫防控用作战略疫苗。因此，研制高质量安全有效的疫苗并不断改进，不但是决定疫苗免疫效果的关键，也是成功预防控制直至最终消灭 FMD 的先决条件。

传统灭活疫苗有良好的功效，但其也有如免疫期短、抗原谱窄、灭活不彻底或操作散毒的危险等不足之处。现在，许多研究人员正在改进和研究新的灭活疫苗生产工艺，使抗原更纯，佐剂更有效，灭活更加可靠，通过筛选新的保护剂使疫苗的保存期更长。因此，纯化浓缩的口蹄疫灭活疫苗在免疫动物后，动物主要产生抗病毒结构蛋白的抗体，不产生或少量产生病毒非结构蛋白的抗体。

2 口蹄疫病毒非结构蛋白（Non Structural Protein，NSP）

口蹄疫灭活疫苗成分主要是口蹄疫病毒结构蛋白，也含有微量的非结构蛋白（Non StructuralProtein，NSP）。口蹄疫病毒的非结构蛋白——FMDV的非结构蛋白是指除了衣壳蛋白 1A、1B、1C、1D 和它们的前体蛋白之外的所有由病毒编码但不参与病毒衣壳组成的蛋白，包括成熟蛋白 L、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D 以及它们的前体。FMDV 的非结构蛋白 3ABC 多聚蛋白是 NSP 的组成部分，其合成后被快速裂解为 3A、3B 和 3C。3A 和 3AB 蛋白有疏水基团，能把病毒锚定在生物膜上，便于 RNA 合成。3B 即 VPg 尿苷酸化后，作为 RNA 的合成引物。 3C 是蛋白酶，催化聚合蛋白的裂解。NSP 参与病毒的复制、多聚蛋白的裂解和病毒颗粒的组装过程。其中 L 和 3C 能抑制宿主细胞的蛋白合成，在病毒蛋白的成熟裂解过程中作为蛋白酶裂解聚蛋白；2A 为 P1/2A 间裂解提供识别序列；2BC、2C、3AB 和 3CD形成复制复合物，为病毒 RNA 的合成创造条件，而且与装配有关。与结构蛋白相比，非结构蛋白的变异较少，相对保守。口蹄疫灭活疫苗中的非病毒蛋白可引起变态反应，另外伴随病毒增殖而产生的病毒非结构蛋白对于动物感染源的鉴别亦带来困难。

3 评价口蹄疫疫苗纯度——监测非结构蛋白抗体

OIE 动物卫生法典规定：在暴发后恢复无 FMD 状态的标准是，如果使用疫苗的话，应检验接种疫苗动物的 NSP 抗体。同样，无 FMD 和接种疫苗的国家，必须通过证明接种疫苗动物没有由于感染产生的 NSPs 抗体。因此，应当纯化可以在这些环境中使用的配方疫苗所使用的 FMD 抗原，以减少 NSP 含量。用现在的制造技术能够去除大部分 NSPs，为的是它们如果有的话，诱导一点点 NSPs 特异性抗体。在这些情况下，NSP 抗体的检测能够提供接种疫苗动物 已经暴露于 FMDV 的证据。总之，纯化浓缩 FMD 抗原，以减少 NSP 含量，同时降低疫苗中非病毒蛋白引起的变态反应，是控制疫苗质量的关键步骤之一。

尽管现代疫苗生产的工艺已经很高，但 FMD 疫 苗仍含有痕迹量的 NSP，免疫特别是多次重复免疫之后，痕迹量的 NSP 蛋白可能刺激机体产生抗体，但除 3D 外，其他 NSP 抗体水平很低。OIE 建议，通过检测接种至少两次口蹄疫疫苗的动物血清，是否产生非结构蛋白抗体，来评价疫苗的纯度。 OIE 推荐的能够使用的检验方法是：用含有最大数目的毒株和主管当局允许的抗原量试验疫苗的混合物接种不低于 8 头幼稚牛。牛应当接种疫苗至少 3 次，间隔 21d ～ 30d，然后，在每次重复接种疫苗前检验，在最后一次接种疫苗后 30d ～ 60d， 检验 NSPs 抗体。

非结构蛋白（NSP）抗体检验，重组 FMDVNSPs（如 23A，3B，2B，2C，3ABC）表达的抗体用各种能够通过不同的 ELISA 形式或免疫印迹来测量，即间接酶联免疫吸附试验和酶联免疫电转移印迹试 验（EITB）。这些 ELISAs 或用提纯的抗原直接地吸附在微量板上，或用来自半-纯化制品 PAbs 或 MAbs 来捕获特异的抗原。Panaftosa 使用的筛选指数的方法已经证明：其他的间接和竞争 ELISA 检测牛 3ABC 抗体有相等的诊断性能的特性。这个同样的研究进一步确证了来自Panaftosa 初步的资料，这个资料表明：这些试验的诊断性能的特性在牛、绵羊和猪上都是有相似的。EITB 试验在南美已经广泛地用作对在前文描述的标准筛选方法的确证试验。更详细的资料可以从泛美卫生组织/世界卫生组织（PAHO/WHO）PanaftosaOIE 参考实验室获得。 美国率先推出了 FMDV 非结构蛋白ELISA诊断试剂盒，在许多国家和地区进行区域性试验，并在美国、阿根廷和中国台湾省申请了专利。Bergmann 用 OIE 参考方法 3ABC-I-ELISA 检测临床持续性感染牛和亚临床感染牛的敏感性低于 97%，他分析这种现象与奶牛处于高免疫抗体水平的压力、暴露于病 毒的时间太短等因素有关。因此，单一的 NSP-ELISA 在免疫牛群中检测不到 NSP 抗体，并不能完全代表此牛群无携带者。针对这种情况，各国学者提出了如下解决办法：

（1）配合使用 3ABC-ELISA 和 EITB，前者用于筛查，后者用于确诊。

（2）采用 2 种或 2 种以上 ELISA 方法以获得临床检测上的高度敏感性和特异性。

（3）采取咽/食道分泌物（O/P 液）进行病毒分离和 PCR 检测及检测唾液 IgA 抗体综合确诊持续性感染动物。

（4）采用新型诊断技术如液相微阵列技术检测多种NSP 抗体。

众所周知，感染口蹄疫病毒动物的 NSPs 抗体为阳性，免疫非纯化疫苗也会产生 NSPs 抗体阳性，这种情况对区分感染与免疫造成干扰，同时影响免疫效果。国内有研究通过实验可以证明高度纯化口蹄疫疫苗免疫动物后 NSPs 抗体为阴性。因此，提高疫苗纯化效果和相应的 NSPs 抗体检测方法结合使用，可以为将来区分感染与免疫群组提供数据支持，为口蹄疫防控及净化起到积极作用。

综上所述，疫苗生产厂家将“疫苗不诱导一个或一个以上 NSPs 的抗体，和能与相应的诊断方法结合使用”成为研究目标。高效灭活疫苗免疫动物体内应该没有病毒非结构蛋白 3ABC 抗体产生，在现代疫苗加工过程中，2C、3A、3B 和 3C 等非结构蛋白应被去除，因此免疫动物体内不会产生针对 NSP 的抗体，只会诱导产生针对病毒衣壳蛋白的抗体。总之，不同检测方法相结合并使用高效的新型疫苗，给预防和消灭 FMD 带来希望。