内容简介
中文摘要
01
以茶树品种'铁观音’的芽叶为供试材料，采用逆转录-聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）技术克隆获得 3 个 WRKY 基因 CsWRKY6（GenBank 登录号：MG298953）、CsWRKY31 （MG298958）和CsWRKY48（MG298961）。它们的开放阅读框长度分别为1 734、1 299和960 bp，分别编码577、432 和319个氨基酸。系统发育树及蛋白结构域分析表明，3个茶树WRKY基因均属于第Ⅱ类WRKY蛋白，都含有高 度保守的DNA结合域（WRKYGQK）和锌指结构组成的WRKY结构域，其中Ⅱb亚类的CsWRKY6和CsWRKY31 锌指结构模式为C-X5-C-X23-H-X-H，Ⅱc亚类的CsWRKY48锌指结构模式为C-X4-C-X23-H-X-H。3个基因在 茶树不同组织中均有表达且具有明显的组织特异性，CsWRKY6在老叶中的表达量显著高于其他组织，CsWRKY31 在花中的表达量最高，CsWRKY48在根和茎中的表达量显著高于叶、茶花和茶果。蛋白互作预测表明3个基因可 能通过与多个基因互作来响应逆境胁迫，荧光定量表达分析显示低温处理能显著上调茶树叶片中3个基因的表 达；在干旱处理下CsWRKY31和CsWRKY48表达均显著上调且在12 h后达到最大，外源脱落酸处理后CsWRKY48 表达迅速上调，而CsWRKY6和CsWRKY31表达下调。推测这3个基因与茶树抗逆响应密切相关。
关键词
02
茶树；WRKY转录因子；组织表达；逆境胁迫
作者及单位
03
王鹏杰，岳川，陈笛，郑玉成，郑知临，林浥，杨江帆，叶乃兴*
（福建农林大学园艺学院/茶学福建省高校重点实验室，福州 350002）
通信作者简介：
叶乃兴，教授，现任福建农林大学茶学福建省高校重点实验室主任，福建省6·18协同创新院茶产业分院副院长，福建农林大学茶叶科技与经济研究所常务副所长。先后荣获福建农林大学优秀教师称号（2013年）、第二届张天福茶叶发展贡献奖（福建张天福茶叶发展基金会；2017年）、第三届中华优秀茶教师（中华茶人联谊会、中华合作时报·茶周刊；2018年）、闽茶之星（海峡两岸茶业交流协会，2019）等荣誉。获得省级科技成果奖励5项，厅局级成果奖励3项，选育全国茶树优良新品种7个（金观音、黄观音、金牡丹、悦茗香、紫牡丹、紫玫瑰、黄奇）；授权发明专利11件，出版（参编）专著或教材12部。
长期从事茶树栽培育种与茶叶品质化学研究，包括茶树种质资源基因分型与鉴定评价、茶树特异种质资源的挖掘与利用、茶树新品种选育与创新利用、茶叶品质化学与品质调控、茉莉花品种资源及香气品质研究。
本文引用格式
04
王鹏杰,岳川,陈笛,郑玉成,郑知临,林浥,杨江帆,叶乃兴.茶树CsWRKY6、CsWRKY31和CsWRKY48基因的分离及表达分析[J].浙江大学学报(农业与生命科学版),2019,45(01):30-38.
本文精要导读
05
茶树[Camellia sinensis (L.) O. Ktunze]作为一种多年生常绿木本植物，是我国南方最重要的经济作物之一，茶叶的优质、高产、稳产与茶树品种、栽培环境及栽培措施密切相关。茶树喜温怕寒，其生长及茶叶加工生产易受多种自然灾害制约。
植物WRKY基因家族是一类对生长发育及逆境胁迫响应有着重要作用的转录因子家族，每个家族成员均含有 1 个或 2 个由 60 个氨基酸组成的WRKY 结构域，N 端具有高度保守的 WRKYGQK核心基序，该序列的氨基酸突变会导致DNA结合活性的显著减弱；而 C 端通常为一段锌指结构 C2H2（C-X4-5-C-X22-23-H-X-H）或 C2HC（C-X7-C-X23-H-X-C）。WRKY转录因子通过特异性结合靶基因启动子区域的W-box元件以调节相关基因转录。自1994年ISHIGURO等首次从甘薯中克隆得到第1个WRKY转录因子SPF1以来，研究者已相继在烟草、杨树、拟南芥、棉花等植物上鉴定得到WRKY转录因子。近年来，随着部分植物基因组数据的公布，发现拟南芥 WRKY 基因家族至少有 74个成员，番茄有 81 个，杨树有 104 个，苹果有132 个。已有大量研究表明，WRKY 转录因子产物作为正调控或者负调控蛋白参与多种生物及非生物胁迫的响应调节；此外，还作为重要调节因子参与植物胚胎发育、种子萌发、叶片衰老、生物合成途径及激素信号传导等生理发育过程。例如转白菜BcWRKY46基因的烟草对低温、盐害及渗透胁迫的敏感性降低；AtWRKY18和AtWRKY60作为正调控因子参与脱落酸（abscisic acid, ABA）信号途径，抑制拟南芥种子萌发、根生长及对盐胁迫和渗透胁迫的敏感性；青蒿中的AaWRKY1可与倍半萜合酶紫穗槐-4，11-二烯合酶基因（amorpha-4, 11-diene synthase, ADS）启动子区域中的W-box元件结合，从而激活ADS基因表达来促进青蒿素的生物合成；辣椒 CaWRKY40 可通过介导水杨酸（salicylicacid, SA）、茉 莉 酸（jasmonic acid, JA）、乙 烯（ethylene, ETH）信号途径来防御青枯病的入侵，并提高植株的耐热性。
目前, 对茶树WRKY转录因子的研究较少，美国国立生物技术信息中心（National Center forBiotechnology Information, NCBI）上仅公布了CsWRKY2（JQ739460.1）和 CsWRKY40（JQ820201.1）2条WRKY基因序列。相关研究在茶树转录组上通过生物信息学鉴定的方法初步得到 50 和 45 个WRKY转录因子；另有报道表明, 茶树CsWRKY2和CsWRKY57通过介导ABA信号途径参与非生物胁迫响应。相比于拟南芥、烟草、水稻等模式植物，茶树WRKY转录因子的转录调控研究才刚起步。本研究根据茶树基因组数据，以茶树品种'铁观音’cDNA为模板，克隆获得茶树基因CsWRKY6、CsWRKY31和CsWRKY48的cDNA序列，对它们进行生物信息学分析，探索其在不同组织、低温条件、干旱条件和 ABA 浓度胁迫下的表达模式，为系统研究WRKY基因在茶树逆境胁迫中的功能提供理论参考。
部分图表
06
结论与讨论
07
植物WRKY基因涉及多种生理过程的转录调控，包括各种逆境胁迫和发育过程。本研究从'铁观音’品种中分离得到3个茶树WRKY基因，其编码产物均属于第Ⅱ类WRKY蛋白，具有高度保守的WRKYGQK核心基序和锌指结构组成的WRKY结构域，其中Ⅱb 亚类的 CsWRKY6 及 CsWRKY31与Ⅱc亚类的CsWRKY48在锌指结构上有所差异。亚细胞定位与核定位信号预测结果一致，3个基因均具有高置信度的核定位信号，且同属于Ⅱb亚类的CsWRKY6和CsWRKY31核定位信号序列相同。核定位信号是一种存在于细胞内众多蛋白质中，介导其由细胞质向细胞核转运的氨基酸序列，对调节目标基因转录具有重要作用。基于 3 个茶树WRKY转录因子WRKY功能结构域的三维结构分析显示，它们均由 5 个反向平行的 β 折叠和无规则卷曲组成，与拟南芥 WRKY1 相似 ，表明茶树WRKY蛋白家族结构域高度保守。
大量研究表明，WRKY转录因子的表达具有组织特异性。对 3 个茶树 WRKY 基因的组织表达特征分析发现，3个基因具有明显的组织特异性，且表达模式各不相同。CsWRKY6 和 CsWRKY31 分别在茶树老叶和茶花中优势表达，CsWRKY48则在根和茎中的表达量最高，这可能与胁迫响应有关。茶树CsWRKY2的组织表达结果显示其在叶片中表达量相对较高，与 CsWRKY6 类似。另外，在拟南芥、苹果和番茄中 WRKY 家族的组织表达也呈现出多种相对表达模式。这些结果表明WRKY基因参与植物生长发育的多个方面。
近年来，已有诸多研究证明，部分WRKY基因可通过介导 ABA 信号途径来响应多种逆境胁迫。我们通过 STRING 在线预测了 3 个茶树WRKY基因的潜在蛋白互作网络，经GO数据库注释及功能分类，发现其置信度较高的互作蛋白多与响应逆境胁迫相关。qRT-PCR 结果表明，CsWRKY6、CsWRKY31 和 CsWRKY48 在低温、干旱及ABA胁迫处理下均有表达且表达水平有所差异。4 ℃低温处理能诱导3个茶树WRKY基因表达量出现极其显著的上调，这与番茄 WRKY 家族中 10 个WRKY 基因及大豆 GmWRKY21的研究结果类似，表明3个基因参与了茶树低温胁迫响应的调控途径。MOON等将辣椒CaWRKY1在马铃薯中异源表达，发现其能显著提高植株对干旱的耐受性；郭俊红等验证表明茶树CsWRKY57无转录激活活性，受干旱诱导短时间内爆发性上调表达。在本研究中 ，干旱胁迫处理能显著上调 CsWRKY31 和CsWRKY48 的表达 ，外 源 ABA 处理则抑制CsWRKY6 及 CsWRKY31 的表达 ，迅速诱导CsWRKY48表达量的上调。前人研究表明，WRKY转录因子是ABA信号调控下游途径的关键节点，通过调控 ABA 信号转导相关靶基因如 ABF4、ABI4、ABI5、DREB1A、MYB2 和 RAB18 的表达来提高植物对逆境胁迫的耐受性；ABA可以诱导部分WRKY家族基因行使功能，由于植物种类或胁迫环境不同，有的为正调控，有的则为负调控；WANG等通过外源 ABA 及 ABA 生物合成抑制剂证明茶树CsWRKY2可介导ABA信号途径参与茶树对低温及干旱胁迫的应答，意味着 CsWRKY6、CsWRKY31 和CsWRKY48可能分别作为负调控和正调控因子参与茶树响应低温和干旱胁迫的ABA信号调控途径，但具体的响应调控机制还有待进一步研究。
总之 ，本研究克隆得到茶树 CsWRKY6 、CsWRKY31 和 CsWRKY48，通过系统的生物信息学分析及在不同组织、低温条件、干旱条件、ABA处理下的表达模式分析，推测这3个基因与茶树抗逆响应密切相关。它们的功能及作用机制值得后续通过转基因功能验证及酵母杂交等技术来进行研究。
联系客服
