一、实验目的与原理
DNA是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象。DNA的提取是分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作。本实验通过植物样品在液氮下研磨以粉碎组织,通过裂解液裂解细胞,有机溶剂反复抽提,使DNA进入水相与蛋白质成分分开,在RNase作用下,降解RNA以纯化DNA。
二、材料以方法
1、 材料:培养菌体
2、 仪器设备:超净工作台,培养箱,摇床,恒温水浴锅,高速冷冻离心机,台式离心机,移液枪一套,低温冰箱,冷冻真空干燥机,电泳仪,水平电泳槽,紫外观测仪
3、 试剂:
细胞裂解液 100 mM Tris-HCl
5 mM EDTA
500 mM NaCl
1.25% SDS
PH 7.5
饱和酚,氯仿/异戊醇,酚/氯仿/异戊醇
无水乙醇,70%乙醇,异丙醇
3 M NaAc pH5.2, RNase,50×TE缓冲液,电泳载样缓冲液
三、操作步骤
(1) 培养菌体
(2) 加入10 ml裂解液,1/10体积酚,于65℃下20-30 min,然后加入等体积的氯仿,轻摇
(3) 12000-15000rpm离心15 min
(4) 取上淸液,加入等体积氯仿,轻摇,12000-15000rpm离心15 min
(5) 取上淸液,加入0.6倍体积冷异丙醇(-20℃)或2倍体积冷无水乙醇(-20℃)
(6) 加入1/10体积的3 M NaAc(pH5.2),置于室温下10 min
(7) 12000-15000rpm离心10 min
(8) 倒弃液体留下沉淀,用70%乙醇洗涤沉淀
(9) 加入2倍体积无水乙醇
(10) 12000-15000rpm离心10 min
(11) 倒弃液体留下沉淀,真空干燥
(12) 复溶于2 ml TE
(13) 加入RNase,65℃或37℃处理10-30 min
(14) 加等体积酚,酚/氯仿,氯仿各一次,12000-15000rpm离心10 min
(15) 取上淸液,加入0.6倍体积冷异丙醇(-20℃)或2倍体积冷无水乙醇(-20℃)
(16) 加入1/10体积的3 M NaAc(PH5.2),置于室温下10 min
(17) 12000-15000rpm离心10 min
(18) 倒弃液体留下沉淀,用70%乙醇洗涤沉淀
(19) 真空干燥沉淀
(20) 复溶于0.5-1.0 ml的TE或水中,分装成小体积,4℃或-20℃保存。
(21) 电泳检测提取DNA的质量
四、结果与分析
点样空,若发亮则说明有污染
超螺旋结构DNA,若条带有拖尾则
说明有破碎的DNA
少量未清除的RNA
五、注意事项
1、 重点防止DNA的损伤,包括各种物理、化学和机械损伤。
2、 干燥好的染色体DNA最好溶于去离子水,以备后面直接利用。如果用TE 缓冲液溶解,后面还需去离子。
3、 取上清时,如果上清液过少,可再加入少量水,重新离心,取上清,避免DNA损失过多。
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