ELISA间接法实验步骤

仪器、原料和试剂
仪器
聚苯乙烯96孔酶标板、微量移液管、酶联免疫阅读仪、洗板仪。
试剂及试剂配制
1. 抗原及酶标记抗体
①抗原： IgG

②酶标抗抗体：羊抗鼠IgG-HRP
2.包被液（CBS）：Na2CO3   0.8g，NaHCO3  1.46g，水溶解，定容500ml。

3. 封闭液（3％BSA+CBS 或5％牛奶+CBS）：含3％牛血清白蛋白（BSA）：10mL CBS中加入0.3g BSA。含5％荷兰牛奶：10mL CBS中加入0.5g牛奶 。
4. 洗涤液（PBST 10*）：KH2PO4   4g，Na2HPO4·12H2O    58g，NaCl   160g， KCl  4g，Tween-20 10mL  加水定容2L。
 5. 洗涤液(1*PBS)： PBST：H2O=1：9

6. 底物溶液（4甲基酰苯氨）
①TMB底物缓冲液(0.005mol/LPH3.6醋酸钠-柠檬酸缓冲液)：称NaAc·3H2O：1.13g，C6H8O7·H2O ：1.05g，用蒸馏水溶解，定容至1000mL，调PH=3.6。
② TMB底物液：称3,3＇,5,5＇-四甲基联苯胺（TMB）0.08g 溶于40mL 二甲基亚砜（DMSO）中，加60 mL 甲醇，混匀，加100mL 底物缓冲液，在暗处避光搅拌2小时至溶解，4℃避光保存。
③H2O2 底物液：取140μL过氧化氢（H2O2）加入200mL底物缓冲液混匀。
④底物应用液：现用现配，TMB:H2O2=1:1混匀。

7. 终止液：2mol/L H2SO4
四、操作步骤
①抗原包被过夜（12h以上）： IgG抗原，用包被液（CBS）稀释，100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反应板中。4℃放置过夜。

抗原用量：0.1μg*100N/抗原浓度 （N为板数）
②封闭：弃上清 加300μL/孔封闭液，37℃放置2h。
③洗涤：用洗涤液洗3次
④加一抗(待测样品为细胞培养上清)：将含单克降抗体的细胞培养上清100μL /孔加到已包被的板上，空白培养基作为阴性对照，已知样品血清（1：200稀释于1%BSA+PBST中）作为阳性对照。37℃恒温箱温育2h。
测免疫效价待测样品为小鼠血清时：采小鼠血液于常温20min左右后放4℃至析出血清，3000r 10min离心。将含抗体的血清在已包被的板上用1%BSA+PBST连续倍比稀释(按照1：200开始)，100μL /孔。每个样品平行做两份，小鼠阴性血清或空白培养基作为阴性对照，已知样品作为阳性对照。37℃恒温箱温育2h。
⑤洗涤：用洗涤液洗5次。
⑥加二抗（酶标抗抗体）：羊抗鼠IgG-HRP，用1%BSA+PBST l ：10000稀释，100μL／孔， 37℃恒温箱温育1h。
⑦洗涤：用洗涤液洗5次，
⑧显色：加新鲜配制的底物溶液(TMB:H2O2=1:1)100μL/孔，37℃恒温箱放置10min，显示蓝色。
⑨终止反应、比色：加30μL/孔H2SO4终止液．颜色变黄；用酶标仪测定450nm  630nm处各孔的吸光值，阳性反应的最大稀释度为待测样品的效价。