嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞产品在靶向CD19分子治疗B细胞恶性肿瘤的临床试验中显示出令人振奋的疗效及较少的副作用，美国食品与药物管理局在2017年批准了两个CAR-T产品上市。针对其它恶性肿瘤的CAR-T细胞治疗研究也在不断地进展中。
CAR-T细胞产品是一种新型的、复杂的生物产品，对其不断的开发将会使越来越多的产品进入临床试验和上市使用，对这些产品的质量控制和非临床研究对于保障这些产品的安全性和有效性具有重要意义，同时也具有较大的挑战。
本文针对CAR-T的具体特点，结合细胞治疗和基因治疗的相关技术指南提出其中的一般原则和关键问题，希望能为相关产品的研发人员和生产人员提供有益参考。
1.
一般原则
质量控制
CAR-T细胞产品的质量控制，须在参考国内外相关指导原则的基础上，从生物产品、细胞产品和基因治疗产品的不同层次综合考虑其特性，进行全面的产品质量、安全性和有效性的检验。
CAR-T细胞作为一种活的“药物”，制备流程复杂、质量控制环节众多，需要对其进行全过程的质量控制。
对于CAR-T细胞生产用材料，研究者应建立良好、规范的质量管理体系，包括使用风险的评估、生产用材料供应商的审计和质量的检测等。原则上，对于适合建立细胞库的供者细胞应建立细胞库对其进行保存和生产。
对于生产过程细胞，如生产病毒载体所用细胞，应符合细胞来源和历史培养情况清晰、安全性和风险可控、质量满足生产工艺以及可建立细胞库管理等基本原则。应对CAR-T细胞生产过程中使用的培养基、血清、细胞因子、酶、抗体、抗生素和磁珠等予以明确规定，并评估其是否适合预期用途。应通过检验特性、纯度、细菌内毒素、无菌性、外源因子和生物活性，来证明其质量。使用的辅料宜优选经批准可用于人体的辅料，否则需要开展全面的研究与评估。
过程控制是对生产工艺过程的监控，包括生产工艺参数的监测和过程控制指标的达成等。过程检验是对生产过程中的细胞进行质量监控，在关键步骤或中间产品的层面对产品的关键质量属性进行相应的检验。
通过将过程检验的检测方法和验收标准与细胞放行检验相结合，达到对整体工艺和产品质量的控制，保证生产过程的可重复性和不同批次最终产品的一致性。
放行检验的基本原则是提供足够的测试，以确保产品的特性、纯度、安全性和有效性等符合相关要求。当在产品的保质期内不能完成整套质控检测程序用于放行时，可应用简化的放行检测程序。在这种情况下，应明确地描述和说明应用简化的放行检测程序的理由，更关键的是，在放行时缺少的信息需要通过合理的过程检验和更广泛的工艺验证进行适当的弥补。检测指标一般应考虑产品鉴定、生物学功效、纯度、杂质、细胞数量（活细胞数、功能细胞数等）和一般检测（如无菌、支原体、内毒素、外观等）。
应对CAR-T细胞产品生产的全过程进行全面的工艺研究和连续多个批次的工艺验证。CAR-T细胞产品稳定性研究的基本原则可参照一般生物产品稳定性研究的要求，并根据产品自身的特点、临床用药的需求，以及保存、包装和运输的具体情况设计合理的研究方案。
非临床研究
CAR-T细胞治疗产品的药效学和药代动力学研究不需要在药物非临床研究质量管理规范（GMP）下进行，但非临床安全性评估研究应符合GMP。用于非临床研究的CAR-T细胞产品可以来源于健康志愿者的捐赠；采用来源于动物的替代产品进行一些概念验证研究也具有重要的支持作用。
目前，CAR-T细胞对肿瘤抑制作用的体内药效学研究常用免疫缺陷鼠的移植瘤模型；鼠源细胞，如A20等，也可被用于建立鼠源模型以评价鼠源CAR-T细胞。研究CAR-T细胞产品药效的最直观的方法为利用生物发光成像技术，检测表达荧光素酶的肿瘤细胞。
最常用的CAR-T细胞药代动力学检测模型为移植瘤模型。非荷瘤模型可用作生物分布研究的对照。CAR-T细胞的药代研究主要关注目标细胞在体内的增殖、分布和存续时间，可选择的技术方法有成像技术、流式细胞术、免疫组化技术、定量PCR技术等，不同的方法适用于不同的检测样本和检测目的。
动物安全性研究除了常规毒理学指标外，还包括免疫毒性指标，如移植物抗宿主反应、外周血细胞计数和表型分析以及血清细胞因子水平等的检测。
另外，如果可能，也可以同时或单独进行安全药理学和局部耐受性等研究。一般不进行常规遗传毒性组合研究和生殖毒性的研究。致瘤性研究也需要进行特殊考虑。
2.
关键问题
质量控制
作为基因治疗的工具，载体可能带来插入突变、病毒复制、外源因子污染等风险，同时其携带的遗传物质是CAR-T细胞的重要组成部分，是使T细胞具有强大的识别和杀伤肿瘤细胞活性的重要基础。因此，载体的质量至关重要。
载体与生产中所用的其它原材料特性完全不同，应作为产品的组成部分进行管理。载体的生产和质量控制应符合已颁布的基因治疗产品指南的要求。基因修饰用载体遵循现行的GMP生产，具有高品质并已经过全面质量检测。应根据不同载体的特点及生产工艺，按照工艺验证和风险评估结果建立合理的质量标准。
CAR-T细胞的微生物安全性主要通过对生产用材料进行严格检测、严格按照现行GMP要求控制生产过程以及对产品进行微生物检验来保证。
CAR-T细胞产品的微生物检测项目包括无菌检查、支原体检查、复制型病毒检测、病毒外源因子检测等。多数情况下，不可能在给药之前对CAR-T细胞产品完成传统的微生物检测。
快速的微生物检测方法亟待被开发。目前已存在一些快速方法可替代传统方法，但需要对这些方法进行优化开发和充分验证，以使之获得国家相关监管机构的认可。
CAR在细胞表面的表达是活性CAR-T细胞产品的关键特征，CAR+细胞的比例是重要的活性指标，可通过流式细胞术和PCR检测。目前，IFN-γ的分泌和细胞毒性测定仍然不能准确预测CAR-T细胞产品的临床疗效和安全性，需要进一步探索更多、更好的效力测定方法。
由于基因修饰用载体可遵循GMP条件规模化生产，其质量的一致性对转染效率的稳定性和CAR-T细胞产品的一致性尤为重要。
由于CAR-T细胞在体外生产过程复杂，良好的过程控制和过程检验可以对生产过程中直接或间接影响产品质量的各种因素进行有效控制，以确保所得产品符合预期的要求，从而保证产品的一致性。
目前一些先进过程分析技术在CAR-T细胞生产过程中的应用有待于进一步研究。另外，自动化生产技术将有助于更好地实现生产的一致性。工艺验证可以为持续生产质量一致的产品提供科学证据。
非临床研究
目前，用于CAR-T细胞非临床安全性研究的动物模型包括移植瘤小鼠、非荷瘤的免疫缺陷鼠、同源小鼠、表达人肿瘤相关抗原的转基因小鼠、免疫系统重建小鼠和非人灵长类（猴）等，其各有优缺点，应根据实际情况选择使用。
目前，还没有合适的动物模型或方法可以在临床前很好地预测CAR-T细胞的神经毒性。有研究认为，CAR-T细胞治疗产生的神经毒性可能与细胞因子水平升高有关。因此，可以考虑尽可能地与其它毒性研究相结合，重点观察临床研究中出现细胞因子释放综合征时的神经毒性。
对于导入了外源基因的CAR-T细胞产品，需通过病毒载体的插入位点分析、体外细胞永生化增殖分析、异常/异位增生性病变（如增生、肿瘤）的体内分析等方法初步评估致瘤风险。体内致瘤性研究可与较长周期的动物毒理学研究同时开展，并可在临床试验期间完成。
鉴于CAR-T细胞是高度个性化的治疗产品，并且往往已经取得了大量的临床研究经验，这类CAR-T产品的动物实验研究应侧重于生物分布和机理/活性验证。最终的安全性和有效性评估应该以临床试验作为最重要的证据来源。
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