研究蛋白互作，这三个经典实验你都知道吗？

在分子机制的研究中，蛋白和蛋白之间的互作研究可以说是非常经典了，因为在十几年前，大家对非编码RNA的研究还没有现在这么热，因为研究的分子是蛋白，找的靶分子也是蛋白，研究的文章发在JBC杂志上的也非常多。

小张有时在想，JBC作为老牌名刊，尽管杂志不能只看影响因子，不过近几年影响因子怎么一直在降呢？都快跌破4分了。当然，JBC不是今天的主题，我们主要说蛋白和蛋白作用。研究蛋白作用的方法有很多，今天我们介绍三个：酵母双杂交，CoIP和GST-pulldown。

酵母双杂交(Yeast Two-Hybrid System,Y2H)

酵母双杂交技术是验证蛋白间相互作用的经典方法之一。原理是在真核细胞调控转录过程中的转录激活因子GAL4的两个结构域：DNA结合域BD与转录激活域AD在分离的时候不具有转录激活功能，而当两者结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。因此，我们将所要研究的目的基因（蛋白A和蛋白B）分别装载到这两个质粒载体中，两个结构域序列则分别与基因的ORF进行融合。当转入相应酵母菌株后，若在酵母内表达的不同蛋白发生互作，则将使GAL4-BD和GAL4-AD相互靠近结合，再进一步与上游激活序列结合，激活相应报告基因的表达。

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）

免疫共沉淀是另一种研究蛋白相互作用的经典方法。原理是如果蛋白A与蛋白B（直接或间接）结合，那么当我们用抗体去结合蛋白A的时候，蛋白B也能被拉下来；当然，反之亦然。因此，首先提取蛋白，然后在提取的蛋白中加入蛋白X的抗体，孵育后再加入Protein A或G(于Agarose 或magnetic beads等介质上)，然后变性、聚丙烯酰胺凝胶电泳，经过Western Blot检测蛋白B，当然，也可以直接将沉淀下来的蛋白通过质谱分析其它蛋白。

GST-pulldown

GST pulldown 是另一项验证蛋白相互作用的经典实验，其基本原理是将靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过WB或者质谱进行检测和鉴定。

以上三种方法是研究蛋白互做最常用的三种方法，一般Y2H常用来筛选，Co-IP和GST pulldown用来验证。研究不仅在整体蛋白层面，还包括蛋白的结构域层面，GST pulldown是用来验证蛋白A与B的直接结合的，而Y2H和Co-IP结果则还有间接作用以及非特异性作用。

最后附上五篇使用以上三种方法研究蛋白质互作，发表在JBC杂志上的经典文章：

1. Wei J D, Kim J Y, Kim A K, et al. RanBPM protein acts as a negative regulator of BLT2 receptor to attenuate BLT2-mediated cell motility[J]. Journal of Biological Chemistry, 2013, 288(37): 26753-26763.

2. Wu F, Peacock S O, Rao S, et al. Novel interaction between the co-chaperone Cdc37 and Rho GTPase exchange factor Vav3 promotes androgen receptor activity and prostate cancer growth[J]. Journal of Biological Chemistry, 2013, 288(8): 5463-5474.

3. De Gois S, Slama P, Pietrancosta N, et al. Ctr9, a Protein in the Transcription Complex Paf1, Regulates Dopamine Transporter Activity at the Plasma Membrane[J]. Journal of Biological Chemistry, 2015, 290(29): 17848-17862.

4. Yang J, Wang Q, Zheng W, et al. Receptor for activated C kinase 1 (RACK1) inhibits function of transient receptor potential (TRP)-type channel Pkd2L1 through physical interaction[J]. Journal of Biological Chemistry, 2012, 287(9): 6551-6561.

5. Guerrera D, Shah J, Vasileva E, et al. PLEKHA7 recruits PDZD11 to adherens junctions to stabilize nectins[J]. Journal of Biological Chemistry, 2016, 291(21): 11016-11029.
   

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