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自1996年Applied Biosystems公司发明了荧光定量PCR后，基于此技术的各种应用在临床和科研领域不断的在扩展。这项技术已经由最初的高大上到了目前非常普及的程度,越来越多的实验室已经建立了荧光定量平台。我们一步步辛苦地喂老鼠，养细胞，提核酸，反转录，定量PCR后，最终得到了一堆看上去离散的Ct值。接下来要做的重要事情是：将数据合理地呈现出来，以支持我们文章的立题。
我们需要面对一系列问题：怎样量化和评价对照组和处理组的差异？“差异具有显著性”和“具有显著差异” 是一回事吗？到底该用哪个表述? “生理学差异（physiologicsignificance）”和“统计学差异（statistical significance）”之间是什么关系？检测类型选单侧or双侧，配对or非配对？
对于一个生物学背景的你，是不是感觉有些隐隐头痛？翻看传统统计学课本，也找不到针对荧光定量PCR数据如何统计的具体章节。没关系！通过下面的图文，上述问题会一步步明朗起来，妈妈再也不用担心我的数据统计了。以研究基因表达差异的相对定量为例，目前常用的方法是KJ Livak（Applied Biosystems）等人在2001年提出的“比较Ct法相对定量”。这种方法利用ΔCt值差异来推算基因表达差异（Ct目的基因 – Ct内参基因 = ΔCt），已广泛被学术界接受，目前文章引用已经多达60720次。
其中的计算原理和方法，网络上的介绍非常多，不再赘述。我们重点来看结果如何统计：在相对定量的最终结果中，我们通常会得到样本间的表达差异倍数（Fold change），比如Treated组相对于Control组的基因表达倍数：
1. 差异如何表示？
那么问题来了，Treated组相对Control组的差异如何来定义呢？
首先，我们需要考虑的是生理学上的差异（physiologic significance）。例如，通常对于基因表达来说，两倍以内的差异被认为是生物学意义不明显的。
其次，由于随机误差的普遍存在，我们也需要考量误差对实验结果的影响，即我们得到的看上去完美的倍数差异，有没有可能不是我们的实验处理造成的，而是随机误差造成的。这时候我们就需要衡量统计学差异（statistical significance）。
我们可以提出假设（hypothesis test），客观上存在两种可能情况:1，我们的这种结果是由于随机误差偶然造成的。2，结果是由实验处理真实客观造成的。那么这两种情况一定会存在各自发生的概率，我们希望第二种情况的概率越大越好。
这个时候，就需要引入一个衡量标准：P值（P-value）。P值是一个什么概念呢？很简单，实际上P值代表了一种可能性。统计学的金标准中，一般要求P值小于0.05(Fisher 1925)。如果P-value=0.05，意味着我们的实验结果有5%的概率是随机误差引起的，也就是假设一的发生概率。那么相应的，这个时候假设二发生的概率为95%。由此，我们可以看出P值实际上衡量的是随机出错的概率，而不是差异的大小。
2. 差异描述的误区
混淆P值的真正含义是数据统计时的一个常见误区。比如，在许多期刊表格的下方都會看到一颗星*代表p<>（显著，significant）,两颗星**代表p<>（极显著，highlysignificant）。很多人自然地觉得p<>的效果比p<>的好，进行差异比较时，组间的差异自然也更大。这样的说法对吗？
回看P值定义，这样的理解实际上是不对的。P值衡量的是随机出错的概率，设定P值边界后，结果只有两种：有差异和没有差异。我们不能说一个P值<>的结果比P值<>的结果具有更大的差异，只能说前者出错的概率更低。
所以在文章里我们怎么正确表述呢？如果P值<>，我们可以说“差异具有显著性”，或者更精确的说“差异有统计意义”（statistical significance），而不是组间“具有显著的差异”（the differenceis great）。P值和衡量差异量变大小的Magnitude，是不同维度的概念。
3. P值如何计算？
既然衡量标准是P值，那我们怎么拿到它呢？算法有很多种，我们以最常用的T检验（T-test）为例。
在Excel中，T检验的公式为：=T.TEST(Group A values,Group B values, tails, type)
公式中有4个元素，前两个为待检测的A和B两组数值容易理解，不过tail和type是什么?
这里的tail不是老鼠尾巴，而是等同于“side”。具体说有单侧（One-tailed）检验和双侧（Two-tailed）检验两类，上述公式中One-tailed = 1 ，two-tailed = 2。
在假设检验中，只强调差异而不注重方向的检验称为双侧检验。既强调差异又注重方向的检验称为单侧检验。选单侧还是双侧，要根据研究的目的来确定。比如，如果我们只关心A和B两组样品是否存在差异，而不关心A>B还是A<>< span=''>，则选双侧检验。而如果我们关注的问题是A>B这个结论是否成立，则考虑用单侧检验。<>
接下来我们来看type，有3种类型：
Type 1 = paired
Type 2 = unpaired,equal variance between the groups
Type 3 = unpaired,unequal variance between the groups
Paired/unpaired主要用来定义个体来源。可以用下面的图来帮助理解：比如我们研究同一只实验鼠在不同时间点的表达差异，即为一个典型的配对检验（paired test）。相应的，我们比较control和treated两组不同老鼠的表达差异，则属于非配对检验（unpaired test）。在基因表达实验中，处理往往会引起组间的不等变异（unequal variance），因此对于非配对检验（unpaired test），选Type 3比较稳妥。
4. 常用的统计软件
当然以上Excel示例只是帮助我们理解处理过程，Excel本身并非专业统计软件。目前市面上有Realtime StatMiner，SPSS，SAS 等软件可供选择，这些软件非常专业。
5. 两点提醒
最后，在你处理数据之前，有两点提醒需要注意：
1）你会发现Excel计算结果往往和软件结果不一致。这是因为大部分的软件在统计中引入了FDR校正（false discoveryrates），可以将多个基因被协同调控（co-regulated）的因素计算进去。所以关掉FDR后，数据才会和Excel计算结果一致（当然，我们不建议你关掉）。下图为ThermoFisher cloud中的FDR设置界面。
2）使用T-test需要基于一个前提：组内数据呈现正态分布（Gaussian distribution）。下图中的A为典型的正态分布，B和C则为非正态分布。如果实验得到的Ct值分布是下图中B和C这两种情况，我们就不能使用T检验了。这个时候需要使用非参数检验（non-parametric test），例如常用的Wilcoxon twogroup test。
Acknowledgment：
Thanks for Dr. John Pfeifer(Sr ApplicationScientist ,Applied Biosystems)’s presentation.
Reference:
Analyzing real-time PCR data by thecomparative Ct method. TD Schmittgen, KJ Livak - Natureprotocols, 2008
The qPCR data statistical analysis. R Goni, P García, S Foissac - IntegromicsWhite Paper, 2009
Statistical analysis of real-time PCRdata .JS Yuan, A Reed, F Chen - BMC, 2006
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