不明觉厉！酰基-生物素交换法是个什么鬼？

作者：老鹏（转载请注：解螺旋·医生科研助手）

大家在读医学研究文献时常常会看到一种不明觉厉的研究技术，叫“Acyl-biotinyl Exchange”，翻译过来就是“酰基-生物素交换法”。这种方法主要用于研究蛋白质所发生的翻译后修饰。

大多数蛋白分子都有多个不同的翻译后修饰机制，用以调节蛋白功能。蛋白质最常见的翻译后修饰方式叫磷酸化，主要发生在丝氨酸、苏氨酸等残基位点上，常常通过特异性的抗体进行检测。

除了磷酸化之外，蛋白质的翻译后修饰的方式还有很多，例如糖基化、乙酰化、甲基化、亚硝基化、谷胱甘肽化、棕榈酰化等等。探索蛋白质翻译后修饰的生物学意义是是生命科学的研究热点之一。

对于医学研究而言，如果你在课题研究过程中发现某种新报道的蛋白质翻译后修饰刚好参与调控疾病过程中该蛋白的功能变化，那么恭喜你，一篇不错的好文章已经在不远处招手啦。

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酰基-生物素交换法是一种常见的检测蛋白质翻译后修饰的方法。蛋白质的半胱氨酸残基上的巯基基团，由于其高反应性，很容易发生各种氧化还原反应或酰化反应。酰基-生物素交换法的实质是将所要检测的翻译后修饰转化为酰基化的生物素基团。

整个交换过程要分三步完成：

第一步，先封闭可能干扰检测的噪音，就是其他可被生物素酰基化的氨基酸残基基团；

第二步，通过某种方式将所检测的翻译后修饰特异性的转变成可进行酰基化反应的状态，如还原态的巯基状态或游离的胺基状态；

第三步，将生物素通过酰基化反应，结合那些转变生成的可发生翻译后修饰的氨基酸残基。这样，原来的蛋白质翻译后修饰会交换成酰基化的生物素。再通过可以选择性结合生物素的亲和素制备层析柱，就可以富集这些生物素化的蛋白，再通过抗体一一检测。

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亚硝基化修饰是一种发生在半胱氨酸残基巯基上的蛋白质翻译后修饰，对很多心脑血管疾病相关的蛋白功能有重要的调节效应。

以亚硝基化为例，可以帮助我们了解如何通过酰基-生物素交换法来研究蛋白质的翻译后修饰。下面让我们一起看看如何在实验室里通过酰基-生物素交换法检测某个蛋白亚硝基化水平吧。

首先，工欲善其事必先利其器。不要嫌麻烦，认认真真的配制几种溶液吧。

第一种，叫HEN buffer（11.9150gHepes羟乙基哌嗪乙磺酸. NaOH，0.0584g乙二胺四乙酸，0.004166g新亚铜树碱，加入到200 ml超纯水中），这可是整个酰基生物素交换反应发生的基础缓冲液哦。

第二种，叫HENS buffer，就是在HEN buffer的基础上，加入一定比例的SDS（一般是把HEN buffer和25%的SDS按9:1配好）。

第三种，叫裂解液，是在第一种HEN buffer的基础上，每毫升体积里加入1% 的NP40 10 μl，protease inhibitor cocktail  10μl，1 mM的PMSF 10μl。裂解液是最先用到的液体，用于破碎细胞或组织。

第四种，叫洗脱液，在第二种HENS buffer的基础上，加入DTT配制而成（一般DTT的终浓度为100-200mM）。

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然后，我们就可以按照上面介绍的三大步，对蛋白质上亚硝基化修饰的巯基来进行Acyl-biotinyl Exchange Reaction了。

第一步，封闭可能产生干扰的噪音：将细胞或组织样本按10μl/mg或500μl/孔（六孔板）加入裂解液，在冰上进行超声裂解处理5分钟, 立即4℃下12000g，离心15分钟。取上清，加入4倍体积的blocking buffer。

所谓的blocking buffer，就是在每ml HENS buffer中加入10ul MMTS储液（MMTS的全称是methyl methanethiosulfonate，是一种特异性的巯基封闭剂，用二甲基甲酰胺配制到2M的储液浓度）。封闭反应在50℃的恒温水箱中进行，一般要20分钟到半小时。

第二步，将亚硝基化修饰的巯基转化为可进行酰基化反应的游离巯基：把裂解液转入离心管里。在离心管中一次性加满-20摄氏度的丙酮，-20℃下静置40分钟，立即4℃，5000g离心20分钟，去除上清。

重复步骤三次后得到比较纯净的蛋白质。去除丙酮上清后，向沉淀加入用HENS buffer所配制的维生素C (20 mM,1ml)，溶解蛋白并将亚硝基化信号转变为可酰基化的巯基分子。

第三步，将生物素通过酰基化反应结合这些转变生成巯基。加入用HENS buffer所配制的生物素biotin–HPDP（1mM, 1ml），室温下孵育2小时（用摇床，一定注意避光）。反应完成后再用丙酮沉淀的方法，去除反应液里小分子，制备纯化蛋白。

把反应液转移入离心管里。在离心管中一次性加满-20摄氏度的丙酮，-20℃静置40分钟，立即4℃，5000g离心20分钟，去除上清。重复步骤三次。用2~3ml的HENS buffer完全溶解沉淀物。

最后，我们还有一个很关键的实验步骤，就是从一堆蛋白质里把亚硝基化修饰的蛋白分拣出来进行抗体检测。不要忘了哦，此时，那些原本亚硝基化修饰的蛋白质早已被换成了带有酰基生物素标签的蛋白，找出它们可一点也不难。

我们用一种填料亲和素-agarose制备成亲和层析小柱，这可是个很高大上的玩意，可以把带有酰基生物素标签的蛋白统统结合上去。

将溶解沉淀蛋白的HENS液灌注亲和素-agarose洗脱柱,循环多次，并用洗脱液冲洗灌注亲和素-agarose洗脱柱（确保洗脱液充满整个柱体），在100℃时处理20分钟后，打开亲和素-agarose洗脱柱下盖，收集含目标蛋白洗脱液，并且用洗脱液继续冲洗2~3次。收集蛋白。

酰基-生物素交换法的步骤虽然比较复杂，但是并不需要特殊的实验设备，属于成本不高但逼格很高。基本上可以做WESTERN BLOTTING实验的实验室都可以做这方面的研究。

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而且，做疾病模型中的蛋白质翻译后修饰的文章还不算很多，相当抢手，可以多多关注哦。

注意事项：

1. 不是所有蛋白都会发生亚硝基化修饰。先做好文献调研。

2. 维生素C还原处理的时间不宜太长。

3. Biotin–HPDP最好配成储液后分装成小支。

4. 丙酮沉淀蛋白后要尽量吹干或挥干里面的丙酮残留。

5. 亲和素-agarose洗脱柱填装制备时要注意推平，不要产生缝隙或气泡。

如果对该技术有兴趣，推荐几篇文献看一看：

1.ffrey SR, Erdjument-Bromage H, Ferris CD, Tempst P, Snyder SH (2001) Protein S-nitrosylation: a physiological signal for neuronal nitric oxide. Nat Cell Biol 3:193–197.

2.ffrey SR, Fang M, Snyder SH (2002) Nitrosopeptide mapping: a novel methodology reveals S-nitrosylation of dexras1 on a single cysteine residue. Chem Biol 9:1329 –1335.

3.stafa AK, Kumar M, Selvakumar B, Ho GP, Ehmsen JT, Barrow RK, Amzel LM, and Snyder SH (2007). Nitric oxide S-nitrosylates serine racemase, mediating feedback inhibition of D-serine formation. Proc Natl Acad Sci USA 104: 2950-2955.