作者:Lucky King(转载请注:解螺旋·医生科研助手)
文献:LincRNA-p21通过海绵微RNA-17-5p抑制肝星状细胞的Wnt/β-联蛋白途径活化(回复170505下载文献)
查阅文献有许多lncRNA参与肝纤维化的进展,为了确定是哪些lncRNA在酚酸B(SalB)处理肝星状细胞(HSC)的模型中发挥活化作用,RT-PCR检测了H19、lincRNA-p21、MALAT1、APTR和GAS5的表达。
与对照相比,模型组中lincRNA-p21和GAS5显著增加,H19、MALAT1和APTR没有影响(Fig.1A),lincRNA-p21和GAS5的表达量分别增加12.6倍和1.4倍;所以选择lincRNA-p21进行下步实验。
检测原代HSC细胞中LincRNA-p21:与第2天相比,lincRNA-p21在第5天下降了52%(Fig.1B),表明在HSC激活期间lincRNA-p21降低。
这些结果表明,在活化的HSC中,lincRNA-p21被下调,可能参与Sal B对HSC活化的过程。
CCK-8检测对增殖影响:空白组Cont、模型组Sal B处理、Sal B+si-Ctrl组、Sal B+lnc-p21组,模型组增殖显著降低,模型增加lnc-p21处理后增殖能力明显恢复(Fig.2A);
RT-PCR结果显示,模型组α-SMA和Col1A1的mRNA表达量显著下降76%和84%,模型+lnc-p21后mRNA表达量几乎恢复正常值(Fig.2B);
与RT-PCR结果一致,WB检测显示模型组α-SMA、TypeⅠ collagen蛋白表达量显著降低,Sal B+lnc-p21组蛋白表达量几乎恢复正常值(Fig.2C-D);
这些数据表明lincRNA-p21在SalB处理的HSC模型中起重要作用。
据文献报道,异常激活的Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)途径参与肝纤维化过程。
WB检测显示,细胞质和细胞核中的Wnt/β-catenin显著增加,同时Wnt/β-catenin途径下游基因C-myc,随培养时间显著增加(Fig.3A);
接着检测Sal B是否对Wnt/β-catenin通路活性有影响。Sal B处理模型组导致TCF活性显著减少,Sal B+lnc-p21组活性恢复(Fig.3B);
Western印迹显示,与空白组相比,模型组P-β-catenin蛋白水平显著增加4.5倍;模型组细胞质细胞核中的β-catenin蛋白水平显著降低。检测转染了si-lnc-p21并经Sal B处理的细胞,lincRNA-p21的沉默显著抑制了P-β-catenin蛋白;同时,lincRNA-p21的缺失使Sal B处理的细胞质、细胞核中β-catenin蛋白水平恢复(Fig.3C);
LaminA为核标记,排除细胞质中核蛋白污染;HSP90细胞质标记,排除细胞核中细胞质蛋白污染,即质控。
LincRNA-p21通过miR-17-5p使Wnt/β-catenin途径失活
作者先前研究miR-17-5p过表达有助于Sal B处理的HSC模型中Wnt/β-catenin通路的激活,接下来研究miR-17-5p、lincRNA-p21和Wnt/β-catenin三者关系。
在lincRNA-p21过表达的HSC中检测miR-17-5p,其表达显著降低(Fig.4A);
生物信息学分析,lincRNA-p21序列中存在miR-17-5p结合位点(Fig.4B);
为了研究lincRNA-p21是否为miR-17-5p的靶标,使用pmirGLO构建含有miR-17-5p结合位点的pmirGLO-lnc-p21-wt(结合位点突变的pmirGLO-lnc-p21-mut)荧光素酶报道子质粒。进行共转染,荧光素酶实验:miR-17-5p+pmirGLO-lnc-p21-wt组荧光素酶活性显著降低(Fig.4C)。
lincRNA-p21是miR-17-5p的靶标,(三个角色,先说清其中两个的关系了)。
接下来再看,miR-17-5p卷入了lincRNA-p21和HSC活化之间的关系。
lincRNA-p21过表达细胞增殖显著受到抑制,将miR-17-5p模拟物转染到lincRNA-p21过表达细胞中,细胞增殖能力恢复(Fig.5A);
RT-PCR和WB显示,lincRNA-p21过表达显著降低α-SMA、Col1A1;但共转染miR-17-5p后,α-SMA、Col1A1表达量显著回升(Fig.5B-D);
证实:①lincRNA-p21在HSC活化中的抑制作用;②这种作用可以被miR-17-5p阻断。表明lincRNA-p21抑制HSC活化的过程,是部分通过miR-17-5p实现的。
miR-17-5p的抑制作用肯定是Wnt/β-catenin这条通路咯,得验证。
仅有lincRNA-p21,P-β-catenin、GSK3β(是Wnt/β-catenin通路关键原件)显著增加,β-catenin显著降低;共转染miR-17-5p后,各指标恢复(Fig.6A);
TCF活性结果相一致(Fig.6B);
将GSK3β基因沉默,RT-PCR检测:lincRNA-p21表达量显著降低,miR-17-5p的表达量显著增加(Fig.6C);
这表明活化的Wnt/β-catenin途径抑制lincRNA-p21,巴特,有助于加强miR-17-5p的表达。
RNA免疫共沉淀表明:与IgG相比,lincRNA-p21和miR-17-5p共沉淀分别为10.5倍和16.1倍(Fig.6D)。根据荧光素酶测定,证实lincRNA-p21吸附到Ago2相关RNA诱导的沉默复合物,并与miR-17-5p具有相互作用。
Atlast,lincRNA-p21诱导Wnt/β-catenin通路的失活是通过miR-17-5p。
本文还是一篇海绵微RNA,所谓海绵RNA,个人理解为是一种缓冲,并不能完全抑制或者完全促进,只能在某种程度内调节。不是非左即右,非黑即白的绝对性,理解起来容易迷糊。
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