咖啡豆如何诱导癌细胞凋亡？靠通路嘛~

作者：Lucky King

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咖啡豆醇通过上调ATF3诱导结肠癌细胞凋亡，回复170620可下载，一月有效

ATF3转录激活因子，activating transcription factor 3，属于含亮氨酸拉链结构的转录因子ATF/CREB家族成员，是一个应激反应诱导基因。

咖啡豆醇介导人结肠癌细胞凋亡

使用0、12.5、25和50μM的咖啡豆醇处理HCT116细胞24小时，蛋白质印迹检测断裂的PARP。用25μM处理HCT116细胞，断裂的PARP略微增加；50μM处理后显著增加（Fig.1A）。

PARP(poly ADP-ribose polymerase)是DNA修复酶，是细胞凋亡核心成员caspase切割的底物，凋亡指标。

此外，使用50μM咖啡豆醇处理SW480、LoVo、HT-29细胞系，断裂的PARP表达显著增加（Fig.1B）。

结果表明：咖啡豆醇可能诱导人结肠直肠癌细胞凋亡。

ATF3表达有助于咖啡豆醇介导的细胞凋亡

用咖啡豆醇处理HCT116细胞24小时，使用ATF3抗体进行蛋白质印迹，剂量依赖性地增加ATF3蛋白水平（Fig.2A）；

此外，在咖啡豆醇kahweol处理的SW480、LoVo、HT-29细胞也观察到ATF3蛋白水平增加（Fig.2B）；

在咖啡豆醇处理3小时后ATF3蛋白水平开始增加，24h达最大值（应当再做个48h…当值持平或者下降时，挑出达到最大值得最小浓度剂量）（Fig.2C）；

ATF3功能实验：构建ATF3表达载体，咖啡豆醇处理，ATF3过表达增加了断裂的PARP水平（Fig.2D）；转染siRNA敲除ATF3，减少了咖啡豆醇介导的断裂PARP水平（Fig.2E）。

这些发现表明：咖啡豆醇介导的ATF3表达可能有助于人结肠癌细胞凋亡。

咖啡豆醇介导的ATF3表达来自转录调控

咖啡豆醇诱导HCT116、SW480、LoVo、HT-29细胞中ATF3的mRNA上调（Fig.3A），这与咖啡豆醇对ATF3蛋白水平的影响相似；

采用荧光素酶实验测量ATF3启动子活性，观察到咖啡豆醇处理HCT116、SW480、LoVo、HT-29细胞后，增强了ATF3启动子活性（Fig.3B）；

在咖啡豆醇处理后3小时，ATF3启动子开始活化（Fig.3C）。

CREB负责kahweol诱导的ATF3启动子激活

为确定kahweol诱导的ATF3启动子激活相关的特定位点，构建ATF3启动子萤光素酶载体（pATF3-1420/+34、pATF3-718/+34、pATF3-514/+34、pATF3-318/+34，pATF3-147/+34和pATF3-84/+34）转染到HCT116细胞中，用50μM的kahweol处理24小时；

pATF3-1420/+34和pATF3-718/+34，将ATF3启动子活性提高了7倍（Fig.4A）

使用含有-147至-84区域的ATF3启动子载体将活性提高了7倍，而没有使用-147至-85区域的载体仅仅稍微增加了ATF3启动子活性，这表明kahweol结合的相应位点/元件可能在-147到-85区域。据报道，Fushi tarazu（Ftz）和CREB是ATF3启动子中的顺式作用元件，含有-147至-85区域。为了鉴定是哪个顺式作用元件起的作用，将每个位点缺失的ATF3启动子载体转染到HCT116细胞中，并用50μM的kahweol处理。

当CREB位点缺失时，kahweol诱导的ATF3启动子活性显著降低。然而，删除Ftz位点并不影响kahweol诱导的ATF3启动子活性（Fig.4B）。

这些数据表明CREB对于kahweol诱导的ATF3表达可能是重要的。

Kahweol诱导的ATF3表达依赖于ERK1/2和GSK3β

为了阐明咖啡豆醇与ATF3表达相关的上游激酶的关系，在HCT116细胞中预处理各种激酶抑制剂如PD98059（ERK1/2抑制剂）、SB203580（p38抑制剂）、SP600125（JNK抑制剂）、LiCl（GSK3β抑制剂）。

添加ERK1/2抑制剂PDK18059、GSK3β的抑制剂LiCl，显著降低了kahweol介导的ATF3表达（Fig.5A、5D）；

But，其他激酶抑制剂并不影响ATF3表达（Fig.5B、5C）。

这些数据表明：ERK1/2和GSK3β可能是kahweol介导的ATF3表达的主要上游激酶。

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