GATK best practice每个步骤耗时如何？

上次我们介绍了完整的 GATK best practice(请点击) 在我的基因组重测续数据分析流程，详细讲解了每个步骤的代码，输入输出文件，准备文件，以及耗时。 但是对同一个样本的多个lane的数据合并的问题，缺失了一个重要步骤，而且有热心的读者咨询整个流程的耗时问题，所以特出此番外篇作为补充。

再次介绍一下我的这次基因组重测续数据共5条lane，都是单独的PE150的fastq文件。

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如果仅对L1这条lane数据进行处理

首先是BWA的比对耗时如下：

1. [main] Real time: 15870.794 sec; CPU: 77463.156 sec

2. picard.sam.SortSam done. Elapsed time: 45.60 minutes.

3. picard.sam.markduplicates.MarkDuplicates done. Elapsed time: 64.20 minutes.

4. picard.sam.FixMateInformation done. Elapsed time: 58.05 minutes.

然后是GATK对bam文件的一些预处理，步骤是：

1. RealignerTargetCreator --> IndelRealigner --> BaseRecalibrator --> PrintReads

后面我会讲到这些步骤是否是必须的。

耗时如下：

1. INFO  15:50:24,097 ProgressMeter - Total runtime 1165.34 secs, 19.42 min, 0.32 hours

2. INFO  17:21:00,917 ProgressMeter - Total runtime 4265.44 secs, 71.09 min, 1.18 hours

3. INFO  19:58:23,969 ProgressMeter - Total runtime 9436.69 secs, 157.28 min, 2.62 hours

4. INFO  23:41:00,540 ProgressMeter - Total runtime 13349.77 secs, 222.50 min, 3.71 hours

可以看到对L1这条lane数据来说，整个流程耗时才不到10个小时，还算是可接受范围内的。

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接下来用HaplotypeCaller找变异

这个步骤我对realign的bam和recal的bam分别处理了，耗时如下：

1. INFO  20:40:49,063 ProgressMeter - Total runtime 39243.88 secs, 654.06 min, 10.90 hours

2. INFO  08:53:17,633 ProgressMeter - Total runtime 43939.69 secs, 732.33 min, 12.21 hours

对bam文件找变异的时间取决于reads数量的多少以及这些reads覆盖的基因组区域大小，虽然一条lane的数据量很小，但它仍然是全基因组测序，如果是全外显子测序这个耗时是不一样的。

整个L1这条lane数据(120M的reads)处理后的文件大小如下所示：

1. 3.0M Jun  7 01:14 L1.bam.bai

2. 8.8G Jun  7 02:33 L1_marked.bam

3. 9.0G Jun  7 03:31 L1_marked_fixed.bam

4. 3.3M Jun  7 03:36 L1_marked_fixed.bam.bai

5. 2.6K Jun  7 02:33 L1.metrics

6. 8.2M Jun  5 17:21 L1_realigned.bai

7. 9.0G Jun  5 17:21 L1_realigned.bam

8. 8.2M Jun  5 23:41 L1_recal.bai

9. 27G Jun  5 23:41 L1_recal.bam

10. 8.1M Jun  5 23:53 L1_recal.bam.bai

11. 39M Jun  5 15:50 L1_target.intervals

12. 320K Jun  5 19:58 L1_temp.table

因为我的这次基因组重测续数据共5条lane，这5条lane的数据其实是可以并行完成这几个步骤的，最长耗时约12小时。 每个数据处理我都分配了 5个线程， 40G的内存。

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merge后不进行AddOrReplaceReadGroups处理

意味着要把5条lane的数据当做是不同的样本，这样后续处理这5个lane的bam矫正以及找变异都是独立进行的，虽然最后生成的vcf文件只有一个，但是每条lane都有独立的基因型。 realign和recal耗时如下：

1. INFO  17:54:59,396 ProgressMeter - Total runtime 5194.10 secs, 86.57 min, 1.44 hours

2. INFO  02:04:10,907 ProgressMeter - Total runtime 22558.84 secs, 375.98 min, 6.27 hours

3. INFO  18:48:45,762 ProgressMeter - Total runtime 60267.18 secs, 1004.45 min, 16.74 hours

4. INFO  21:30:54,519 ProgressMeter - Total runtime 96119.87 secs, 1602.00 min, 26.70 hours

同样还是对realign的bam和recal的bam分别用HaplotypeCaller找变异

1. INFO  19:36:31,960 ProgressMeter - Total runtime 201031.47 secs, 3350.52 min, 55.84 hours

2. INFO  22:59:21,693 ProgressMeter - Total runtime 184944.78 secs, 3082.41 min, 51.37 hours

可以看到这个时候的耗时相比仅针对一条lane已经是非常恐怖了，近100个小时。不仅仅是因为这个时候reads数量增多，而且是因为5条lane独立样本处理。

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merge后需要AddOrReplaceReadGroups处理

这个才是正确的做法，因为不同的lane出来的数据都是我本人的全基因组重测续数据，后续处理应该是当做一个样本的，所有需要AddOrReplaceReadGroups处理，代码是：

1. ### AddOrReplaceReadGroups ###

2. java -Djava.io.tmpdir=$TMPDIR    -Xmx40g -jar $PICARD AddOrReplaceReadGroups \

3. INPUT=${sample}.bam OUTPUT=${sample}_tmp.bam   RGID=jmzeng  RGLB=lib_all  RGPL=illumina RGPU=x10  RGSM=jmzeng

4. mv ${sample}_tmp.bam ${sample}.bam

5. samtools index ${sample}.bam

这个代码需要结合前面的GATK best practice一起理解。

realign和recal耗时如下：

1. INFO  15:52:21,739 ProgressMeter - Total runtime 3573.62 secs, 59.56 min, 0.99 hours

2. INFO  22:46:39,615 ProgressMeter - Total runtime 24853.46 secs, 414.22 min, 6.90 hours

3. INFO  16:06:14,340 ProgressMeter - Total runtime 62366.41 secs, 1039.44 min, 17.32 hours

4. INFO  18:18:08,004 ProgressMeter - Total runtime 94304.46 secs, 1571.74 min, 26.20 hours

这个耗时跟上面把lane当做是独立样本的没有什么区别，因为耗时取决于reads数据量。

接下来找变异，我不仅仅是对realign和recal，还加入了最原始的bam，全部耗时如下：

1. INFO  02:29:32,680 ProgressMeter - Total runtime 149229.64 secs, 2487.16 min, 41.45 hours

2. INFO  02:15:39,234 ProgressMeter - Total runtime 148379.91 secs, 2473.00 min, 41.22 hours

3. INFO  21:20:51,032 ProgressMeter - Total runtime 130663.06 secs, 2177.72 min, 36.30 hours

可以看到这些耗时都显著的小于把lane当做独立样本。总流程耗时仍然超过了80个小时，这也就是为什么时隔10天我才推出番外~~~

全部流程输出的文件大小如下:

1. 59G Jun 14 14:17 jmzeng.bam

2. 8.4M Jun 14 14:52 jmzeng.bam.bai

3. 1.1G Jun 21 02:29 jmzeng_merge_raw.snps.indels.vcf

4. 12M Jun 21 02:29 jmzeng_merge_raw.snps.indels.vcf.idx

5. 8.4M Jun 14 22:46 jmzeng_realigned.bai

6. 59G Jun 14 22:46 jmzeng_realigned.bam

7. 1.1G Jun 21 02:15 jmzeng_realigned_raw.snps.indels.vcf

8. 12M Jun 21 02:15 jmzeng_realigned_raw.snps.indels.vcf.idx

9. 8.5M Jun 16 18:18 jmzeng_recal.bai

10. 161G Jun 16 18:18 jmzeng_recal.bam

11. 8.5M Jun 16 19:39 jmzeng_recal.bam.bai

12. 1.1G Jun 20 21:20 jmzeng_recal_raw.snps.indels.vcf

13. 12M Jun 20 21:20 jmzeng_recal_raw.snps.indels.vcf.idx

14. 47M Jun 14 15:52 jmzeng_target.intervals

15. 323K Jun 15 16:06 jmzeng_temp.table

值得注意的是，recal之后的bam文件是原始bam的3倍大小，特别耗费存储空间。

接下来我会讲解realign和recal步骤的必要性，毕竟这两个步骤也的确太耗时了，尤其是recal，不仅仅耗时还特别占硬盘存储。